Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора теломеразы человека hTERT, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
ИММУНОТЕРАПИЯ ВИРОТЕРАПИЯ АДЕНОВИРУСЫ ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ СЕРОТИП 6 ОНКОЛИТИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ
Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей, в частности к онколитическим аденовирусным векторам. Оно может быть применимо в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (ГМ-КСФ) в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису, для включения противоопухолевого иммунного ответа. Настоящий штамм аденовируса как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов обладает целым рядом преимуществ. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях - вирусных фабриках, не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. Аденовирус серотипа 6 имеет более низкую серопревалентность, что увеличивает эффективность его использования в качестве противоопухолевого препарата. Настоящее изобретение относится к генной терапии злокачественных опухолей. Более точно, настоящее изобретение относится к онколитическим аденовирусным векторам и фармацевтическим композициям, содержащим такие векторы. Настоящее изобретение также относится к применению указанных векторов в производстве лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам продуцирования гранулоцитарно макрофагально колониестимулирующего фактора человека (ГМ-КСФ) в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису, для включения противоопухолевого иммунного ответа.
С середины XIX века известно множество кейс-репортов, когда регрессия опухоли совпадала с естественным заражением вирусной инфекцией. Чаще всего такие пациенты страдали от гематологических новообразований, таких как лейкемия или лимфома, которые ассоциированы со значительным снижением работы иммунитета. В одном часто цитируемом случае, произошедшем в 1896, доктор Джордж Док описал временную ремиссию после перенесенного гриппа у 42-летней женщины, больной лейкемией [1]. Однако эффект был заметен и на солидных опухолях, схожий случай регрессии был зафиксирован в 1912 году, когда больной раком шейки матки вводилась вакцина от вируса бешенства после укуса собаки.
Ко второй половине XX века накопилось достаточно большое количество подобных единичных случаев, когда естественное заражение вирусной инфекцией производило противоопухолевый эффект. Вследствие этого к середине двадцатого столетия идея использования вирусов стала набирать популярность. В 1950-1970 годы было начато множество клинических испытаний для исследования методов лечения, предполагающих введение различных представителей некоторых вирусных семейств, включая вирусы гепатита (Hepadnaviridae, Picornaviridae, Flaviviridae), лихорадку Западного Нила (Flaviviridae), желтую лихорадку (Flaviviridae), лихорадку денге (Flaviviridae), болезни Ньюкасла (Paramixoviridae), а также аденовирусов [3]. Поскольку на тот момент еще не возникли генно-инженерные методы, и молекулярные механизмы действия вирусов оставались неизвестными, использовались неаттенуированные вирусы дикого типа, что часто приводило к тяжелым побочным эффектам. К 90-м годам стали понятны некоторые молекулярные механизмы процессов, протекающих при заражении клеток вирусами, а также возник инструментарий генной инженерии. В настоящее время ведется более тысячи клинических испытаний противоопухолевых препаратов на основе различных вирусных векторов, среди которых, согласно ресурсу http://www.abedia.com/wiley/index.html. одними из наиболее часто встречающихся (26%) являются аденовирусы.
Существенными достоинствами аденовирусных векторов являются относительная простота получения очищенных вирусных суспензий, неспособность интегрироваться в геном клеток, рекомбинантные аденовирусы довольно стабильны и экспрессия встроенных генов может достигать высоких уровней [4]. Изначально для онколитической виротерапии создавались аденовирусные векторы, которые были лишены области ранних генов, необходимых для вирусной репликации. В настоящее время более перспективными противоопухолевыми агентами являются условно репликативные аденовирусы, либо экспрессию ранних генов контролируют опухолеспецифическими промоторами. Кроме того, появилась стратегия "вооружения" векторов генами-иммуномодуляторами для усиления противоопухолевого иммунного ответа.
Аденовирусы в генной терапии начали активно использовать в начале 90-х годов. Были предприняты попытки доставки дисфункциональных и дефицитных генов при различных заболеваниях [5, 6]. Разработка препаратов потребовала более тщательного изучения безопасности использования аденовирусных векторов в генной терапии. На данный момент наиболее часто встречается вариант с удаленными 24 п.о. в участке малого белка Е1А, отвечающего за связывание белков семейства ретинобластомы и выход из ареста клеточного цикла [7-9]. Такой вариант позволяет вирусу селективно реплицироваться в клетках с нарушенным Rb-путем.
Еще один способ модификации аденовирусных векторов для адресного воздействия на опухолевые клетки заключается во внедрении в геном ткане- и/или опухолеспецифичных промоторов вместо природного промотора области Е1А [10-12]. Одним из вариантов подобных модификаций является встройка промотора теломеразы человека hTERT, поскольку активна в более чем 90% злокачественных клеток [13]. Было установлено, что такие аденовирусные векторы подавляют рост опухоли in vitro и in vivo, проявляя при этом специфичность к опухолевым клеткам [14, 15]. Кроме того, онколитический аденовирус ОВР-301 с промотором hTERT был протестирован в клинических испытаниях 1 и 2 фаз, в доклиническом исследовании с антителом против PD-1 с хорошими результатами [16].
Несмотря на способность аденовирусов активировать разные звенья иммунного ответа, использование диких типов или аттенуированных векторов не приводит к полному уничтожению метастазирующих опухолей, вероятно, из-за их иммуносупрессивного клеточного микроокружения. Использование онколитических векторов с генами-иммуномодуляторами должно приводить к разрушению этой супрессии и, следовательно, к более эффективной терапии [17]. Примерами используемых трансгенов являются цитокины, хемокины, костимулирующие молекулы и молекулы BiTEs (Bi-specific T-cell engagers) [18].
Такой цитокин как ГМ-КСФ может нарабатываться в достаточном количестве в инфицированных клетках, затем в результате онколиза высвобождаться в микроокружение опухоли для стимуляции антиген-презентирующих клеток, в том числе дендритных клеток, которые взаимодействуют с CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами [19]. Клинические исследования с участием онколитических аденовирусов со встройкой гена ГМ-КСФ показывают хорошие результаты и безопасность применения таких векторов [20-22].
Одним из наиболее близких аналогов к создаваемому в рамках темы НИР аденовирусному вектору является конструкция онколитического аденовирусного вектора, разработанная китайской компанией Чэнгду Кангхонг Байотекнолоджиз (патент России 2361611, опубл. 20.06.2009). Вектор содержит генетически улучшенный промотор теломеразы человека, контролирующий ключевые для репликации вируса гены, а также встройку гена человеческого ГМ-КСФ. Однако данные модификации до сих пор применялись только к Ад5, но на основе Ад6 пока не было создано онколитических аденовирусов с подобными модификациями.
Использование Ад5 в качестве онколитика осложнено тем, что это широко встречающийся серотип, из чего следует высокая распространенность предсуществующего иммунитета, ограничивающий время существования вируса в организме пациента, получающего терапию [23]. Другая проблема кроется в способности клеток Купфера захватывать Ад5 из кровотока, что приводит к воспалительной реакции в печени, повышенной гепатотоксичности, а также снижению времени циркуляции вируса [23, 24]. Вариантом решения данной проблемы является использование альтернативных серотипов, среди которых наиболее близким к Ад 5, но при этом лишенным указанных недостатков является аденовирус серотипа 6 (Ад6) [25].
Техническим результатом является создание онколитического аденовируса серотипа 6, обладающего пониженной серопревалентностью, избегающего связывания клетками Купфера, предназначенного для лечения злокачественных опухолей, продуцирования гранулоцитарно макрофагально колониестимулирующего фактора человека в опухолевой клетке, подвергаемой онколизису и включения противоопухолевого иммунного ответа.
Результат достигается созданием Рекомбинантного штамма Ad6-hTERT-GMCSF, сконструированного на основе штамма аденовируса серотипа 6, содержащего встройку промотора теломеразы человека (hTERT), структура которого соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) позиции 10854-11273 в месте удаленного промотора гена Е1А между позициями соответствующими позициям нуклеотидов 357-558 штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315), а также гена гранулоцитарно макрофагального колониестимулирующего фактора человека, структура которого соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM 000758) позиции 36-469, в месте удаленных генов Е3-6.7к и Е3-gp19k между позициями 28608 и 29270, обладающего избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующего активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.
Модифицированный геном аденовируса серотипа 6, содержит:
- левый ITR
- промотор hTERT
- последовательность аденовируса, включающая гены от Е1А до Е3-12.5К
- ген человеческого GMCSF
- последовательность аденовируса, включающая гены от Е3-13.4К до правого ITR
Создание штамма достигается за счет гидролиза эндонуклеазой рестрикции AsiSI продукта гомологичной рекомбинации in vitro при помощи набора In-fusion (Takara Bio, Япония) между ДНК Ад6 штамма ЛМВ, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции по сайтам ClaI и PacI, и плазмидной ДНК pBRAd4.2. Плазмида pBRAd4.2 (фиг. 1) была сконструирована на основе pBR322 за счет последовательных встроек фрагментов ДНК Ад6 штамма ЛМВ, соответствующих позициям нуклеотидов штамма Ад6 Tonsil99, депонированного в GenBank (Accession HQ413315): 1-1772, где вместо нуклеотидной последовательности 357-558 встроена последовательность промотора hTERT, затем 27576-27665 и 27667-35759, где вместо нуклеотидной последовательности 28608-29270 встроена последовательность гена ГМ-КСФ человека. Также были встроены сайты гидролиза эндонуклеазой рестрикци AsisI слева от участков, соответствующих позициям 1-1772 Ад6 и справа от участков, соответствующих 27667-35759 Ад6. Последовательность промотора теломеразы человека hTERT соответствует коровому промотору гена теломеразы человека, депонированного в GenBank (Accession АН007699) позиции 10854-11273, но имеет дополнительные встройки: сайтов рестрикции BamHI слева от последовательности промотора, PstI справа от последовательности промотора и последовательность Козак GCCACC, примыкающая справа от сайта рестрикции PstI. Последовательность гена ГМ-КСФ человека соответствует кодирующей последовательности мРНК человеческого ГМ-КСФ, депонированного в GenBank (Accession NM_000758) позиции 36-469. Полученная в результате рекомбинации между плазмидой pBRAd4.2 и геномной ДНК Ад6 штамма ЛМВ плазмида pAd6-hTERT-GMCSF затем подвергалась гидролизу эндонуклеазой рестрикции AsiSI и дальнейшей трансфекции в клетки НЕК Ad293.
Штамм обладает следующими признаками: Морфологические признаки. Штамм относится к семейству Adenoviridae рода Mastadenovirus и обладает признаками, характерными для аденовирусов вида С: икосаэдрический вирион, однако отличается дополнительной экспрессей ГМ-КСФ и hTERT-зависимой репликацией.
Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного Ад6 имеет длину 35779 п.н. Наличие в его геноме встроек промотора hTERT и гена человеческого ГМ-КСФ было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Селективная репликация в hTERT-положительных клетках была подтверждена методом ХТТ(фиг. 3). Цитотоксическое действие вируса подтверждена методом ХТТ на клетках двух раковых линий (фиг. 4).Экспрессия гена ГМ-КСФ человека подтверждена Western blot анализом культуральной среды и лизатов клеток А549, инфицированных штаммом Ad6-hTERT-GMCSF (фиг. 5). Биологическая активность секретируемого рекомбинантного ГМ-КСФ была оценена в культуре клеток эритролейкоза человека TF-1, которая является ГМ-КСФ зависимой и пролиферирует только в присутствии ГМ-КСФ и ряда других цитокинов человека (фиг. 6).
Заявляемый штамм аденовируса, как платформа для конструирования противоопухолевых и вакцинных препаратов, обладает целым рядом преимуществ. Он реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток в автономных образованиях -вирусных фабриках, не контактирует с клеточным генетическим материалом, не встраивается в хромосомы, не имеет онкогенного потенциала. Аденовирус серотипа 6 имеет более низкую серопревалентность, что увеличивает эффективность его использования в качестве противоопухолевого препарата. Заявляемый штамм аденовируса Ad6-hTERT-GMCSF получен на основе штамма ЛМВ.
Штамм аденовируса может быть применен в терапии злокачественных новообразований.
Антон
Кескинов
Артурович
Начальник управления организации проведения  научных исследований
Кандидат медицинских наук
Отсутствует
-
55938780900
641737
0000-0001-7378-983X
РОССИЯ
Владимир
Слободян
Григорьевич
Помощник генерального директора
РОССИЯ
34.15.51
Молекулярная онкология
34.15.31
Молекулярная биология вирусов
34.15.27
Генетическая инженерия
34.25.37
Вирусные препараты
02.06.IG
ENGINEERING, BIOMEDICAL
03.02.DM
ONCOLOGY
01.06.CQ
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
Иван
Осипов
Дмитриевич
РОССИЯ
Маргарита
Романенко
Владимировна
РОССИЯ
Сергей
Куцейкин
Сергеевич
РОССИЯ
Сергей
Нетёсов
Викторович
РОССИЯ
ФМБА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ АГЕНТСТВО
1057746023147
Организация
Федеральное медико-биологическое агентство
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБУ "ЦСП" ФМБА России
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства
1027700168495
Организация
Федеральное медико-биологическое агентство
Федеральные государственные бюджетные учреждения