ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ СИСТЕМЫ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА CRISPR/CAS9, КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕАЗУ CAS9, ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ОДНОДОЛЬНЫХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР НА ОСНОВЕ ДВОЙНОГО ОТБОРА РАСТЕНИЙ
системы редактирования генома CRISPR/Cas9 нуклеаза Cas9 ген-селективный маркер bar репортерный ген gfp редактирование генома зерновых культур
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической конструкции на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, кодирующей нуклеазу Cas9, содержащей ген-селективный маркер bar и репортерный ген gfp. Изобретение обеспечивает эффективный отбор модифицированных растений без дополнительных молекулярно-биологических тестов. 6 ил., 2 пр.Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, а именно к технологии редактирования генома растений CRISPR/Cas9, в частности редактирования генома зерновых культур.

Предшествующий уровень техники

Несмотря на большой потенциал систем геномного редактирования ДНК, таких как CRISPR/CAS9, для получения новых высокопродуктивных сельскохозяйственных культур, их внедрение в широкую селекционную практику имеет ряд ограничений. Как правило, геномное редактирование достигается с помощью стандартных методов трансгеноза, а именно путем переноса в регенерирующие клетки растений последовательностей «инструментов редактирования». В случае систем CRISPR/CAS9 - это генетические последовательности, обеспечивающие экспрессию нуклеазного агента, который состоит из белка Cas9 и направляющей РНК, называемой РНК-проводником (sgRNA), образующих комплекс Cas9-sgRNA для таргетной модификации определенной нуклеотидной последовательности. При этом последовательности, кодирующие Cas9 и sgRNA, могут находиться как на одном, так и на разных генетических векторах. Доставка последовательностей инструментов геномного редактирования в клетки зерновых культур чаще всего осуществляется методом биобаллистики, позволяющим переносить несколько векторов одновременно. Для облегчения работ по геномному редактированию, один из векторов может быть универсальным (не изменяемым), тогда как второй создаваться для модификации конкретного участка генома.

Задачей изобретения является разработка универсального вектора, который может быть использован в системах CRISPR-Cas9 для редактирования генетических последовательностей зерновых культур, а именно ДНК-конструкции, кодирующей последовательность белка Cas9 и содержащей последовательности, обеспечивающие эффективный отбор модифицированных растений.

Проблема эффективной регенерации in vitro и отбора трансгенных растений после переноса гетерологичных последовательностей в клетки зерновых культур давно известна. При использовании технологии геномного редактирования CRJSPR/Cas9 проблема еще больше осложняется тем, что необходимо отобрать растения, в которых благодаря успешному переносу последовательностей компонентов системы CRISPR/Cas9 и их экспрессии произойдет редактирование гена-мишени. В настоящий момент нет универсальных и эффективных способов отбора трансгенных/геномно-редактированных растений зерновых культур среди растений-регенерантов, образующихся из клеток, подвергнутых бомбардировке. Это связано с тем, что при трансгенозе зерновых не существует селективных генов-маркеров, которые могут обеспечить 100% отбор. Чаще всего для однодольных злаковых культур используют генетические конструкции, содержащие селективный ген bar (bialaphos resistance) или его аналог - ген pat (phosphinothricin acetyl transferase), клонированные из геномов различных видов Streptomicis. Этот ген кодирует фермент фосфинотрицин-ацетилтрансферазу, который ацетилирует три аминогруппы L-фосфинотрицина. L-фосфинотрицин является компонентом гербицидов "Basta", "Liberty", "Harvest", "Herbiace", "Bialaphos" и "Ignite", которые способны блокировать метаболический путь с участием фермента глютамин-синтазы, нарушая процессы ассимиляции аммиака в клетках, что вызывает гибель растений из-за его накопления (Wilmink и Dons, 1993). Поскольку продукт гена bar ацетилирует фосфинотрицин, последний теряет сродство с глютаминсинтазой, и растения приобретают устойчивость. Для геномного редактирования зерновых культур, также чаще всего используют вектора, содержащие ген bar для отбора растений. При биолистическим переносе его чаще используют на отдельной плазмиде, не содержащей последовательностей инструментов геномного редактирования. Тогда как при агробактриальном переносе bar ген размещают на одном векторе с последователостями нуклеазы Cas9. Например, в работе Zhang et al. (2018; Doi: 10.1186/s 12870-018-1496-х) для мутагенеза пшеницы применяли вектор, который одновременно содержал последовательности Cas9 и гена bar. Аналогичную стратегию использовали Lee et al. (2019; Doi: 10.1111/pbi.12982) для геномного редактирования кукурузы, сочетая в Т-ДНК бинарного вектора различные варианты последовательностей нуклеазы Cas9 с последовательностью гена bar. В указанных работах для экспрессии bar гена использовали 35S промотер вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S). Несмотря на то, что ген bar значительно более эффективен, чем другие селективные гены для однодольных культур, при его использовании приходится выявлять трансгенные растения среди огромного числа нетрансгенных проростков. Вследствие природной устойчивости к L-фосфинотрицину доля таких побегов-регенерантов у отдельных сортов зерновых, например пшеницы, может достигать 95%. Распространенная в настоящий момент система отбора трансформантов по устойчивости к гербициду приводит к тому, что скрининг первичных образцов становится затратным и трудоемким, поскольку для поиска и отбора приходится активно использовать молекулярно-биологические методы.

Решением этой технической проблемы может быть добавление в векторную конструкцию, содержащую компоненты редактирования генома, не только селективного гена bar, но и дополнительного репортерного гена, который позволит вести прижизненную детекцию клеток и тканей. В качестве таких генов могут выступать гены, кодирующие флуоресцентные белки, например GFP или RFP. Экспрессия gfp (rfp) обеспечивает специфическую флуоресценцию клеток при помещении их в УФ свет определенного спектра, и таким образом является «визуальным» маркером трансгенной ткани, позволяя отбраковывать нетрансгенные растения на всех этапах.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание генно-инженерной конструкции, которая позволяет получить растения злаковых культур, содержащие компоненты геномного редактирования CRISPR/Cas9, благодаря эффективному «двойному» отбору по селективному гену bar и репортерному гену gfp. Он основывается на одновременном отборе ткани по устойчивости клеток к веществу (гербициду), находящемуся в культуральной среде (экспрессия гена bar), и по флуоресценции трансгенной ткани (экспрессия гена gfp). Сочетание в векторе генов gfp и bar позволяет выявлять трансгенные растения без дополнительных молекулярно-биологических тестов, что сокращает время и ресурсы.

Для создания векторной конструкции использовали маркерные гены, слитые с промотором/интроном генов актина Act1 или убиквитина Ubi1 риса и кукурузы. Применение этих регуляторных элементов обеспечивает высокую экспрессию в тканях пшеницы, начиная от первичной клетки и заканчивая полноценными растениями и семенами, что повышает возможность целевого редактирования.

Созданный вектор можно применять для получения «базовых» растений, экспрессирующих Cas9, которые в дальнейшем можно будет использовать для редактирования целевых генов-мишеней с помощью ген-специфичных РНК-проводников. Разработанная конструкция также пригодна для совместного переноса с векторами, несущими последовательности РНК-проводников, специфичных для различных генов-мишеней в исследованиях по получению отредактированных растений зерновых злаковых культур, включая пшеницу, рис, кукурузу, тритикале и ячмень.
Созданный вектор можно применять для получения «базовых» растений, экспрессирующих Cas9, которые в дальнейшем можно будет использовать для редактирования целевых генов-мишеней с помощью ген-специфичных РНК-проводников. Разработанная конструкция также пригодна для совместного переноса с векторами, несущими последовательности РНК-проводников, специфичных для различных генов-мишеней в исследованиях по получению отредактированных растений зерновых злаковых культур, включая пшеницу, рис, кукурузу, тритикале и ячмень.
Дмитрий
Мирошниченко
Николаевич
старший научный сотрудник
Кандидат биологических наук
Отсутствует
-
6602479664
138950
РОССИЯ
Геннадий
Карлов
Ильич
Директор
РОССИЯ
34.23.57
Генетика и селекция растений
01.06.KM
GENETICS & HEREDITY
Вадим
Тимербаев
Рафаилович
Исполнитель
РОССИЯ
Анна
Клементьева
Александровна
Исполнитель
РОССИЯ
Сергей
Долгов
Владимирович
исполнитель
РОССИЯ
Ольга
Шульга
Альбертовна
исполнитель
РОССИЯ
Дмитрий
Мирошниченко
Николаевич
Руководитель
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБНУ ВНИИСБ
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной   биотехнологии»
1037739342123
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения