2-Амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид, проявляющий цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека
цитотоксическая активность лекарственный противоопухолевый препарат
Изобретение относится к области медицины, конкретно к 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиду формулы I, который проявляет цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека и может найти применение для лечения онкологических заболеваний. 2 ил., 1 табл.

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)


Заявляемое соединение относится к области медицины, производным 2-аминопиррола, а именно к новому биологически активному 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиду I, имеющему формулу:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне),

который может найти применение в медицине в качестве лекарственного противоопухолевого препарата.

Задачей изобретения является получение 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (2-АБФПК), который может быть использован в медицине в качестве действующего вещества лекарственного препарата для лечения опухолевых заболеваний.

Ближайшим структурным аналогом к заявленному соединению являются соединения общей формулы II, проявляющие противоопухолевую, антиоксидантную активность и описаны в патенте:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

2-Амино-1-арил-5-(3,3-диметил-2-оксо-бутилиден)-4-оксо-N-(тиазол-5-ил)-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиды, проявляющие противоопухолевую и антирадикальную активность, способ их получения и фармацевтическая композиция на их основе: патент на изобретение РФ №2605091 по заявке 2015117807: МПК C07D 417/12, А61К 31/427, А61Р 35/00 / С.С. Зыкова, С.В. Бойчук, Н.М. Игидов, Т.Ф. Одегова, А.В. Захматов, А.Р. Галембикова, Б.Р. Рамазанов. - Заявл. 12.05.2015.

В качестве прототипа биологической активности нами взят противоопухолевый препарат - паклитаксел [Патент №2059631, МПК C07D 305/14, А61К 31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: №91 5010248: заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентино Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью].

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

LD50 паклитаксела в тесте острой токсичности составляет 48 мг/кг.

Заявляемое соединение 2-АБФПК в тесте острой токсичности на мышах при внутрибрюшинном введении в виде суспензии в 2% крахмальной слизи имеет токсичность более 1000 мг/кг [Колла В.Э., Сыропятов Б.Я. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных, М.: Медицина, 1998, 263 с.]

Целью предлагаемого изобретения является биологическая активность не описанного 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (I, 2-АБФПК) проявляющего цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток человека. Поставленная цель достигается получением 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (I) взаимодействием 4-(4-бромфениламино)-2-трет-бутил-5-оксо-2,5-дигидрофуран-2-илацетата (II) с цианоацетамидом в присутствии триэтиламина в среде толуола по схеме:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Методика получения 2-амино-1-(4-бромфенил)-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида. 1.84 г (0.005 моль) 2-трет-бутил-4-(4-бромфениламино)-2,5-дигидро-5-оксофуран-2-илацетата (I) и 0.42 г (0.005 моль) цианоацетамида растворяли при нагревании в 90 мл толуола, добавляли 0.5 г (0.005 моль) триэтиламина, кипятили в течение 20 минут. Выпавший осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из этанола. Получали 1.04 г (62%) кристаллического вещества (I) с Тпл 209-210°С. C13H9BrN3O3. ИК-спектр, ν/см-1, вазелиновое масло: 3414 (NH), 3309 (NH), 1689 (С=O), 1673 (С=O), 1621 (C=N, С=С). Спектр ЯМР 1Н, δ, м.д.: 1.09 с (9Н, (t-Bu), 5.61 с (1Н, СН), 6.87 уш. с (1Н, NH), 7.34 уш. с (1Н, NH), 7.40 д (2Наром, J 8.6 Гц), 7.79 д (2Наром, J 8.4 Гц), 8.18 уш. c (1H, NH), 8.51 уш. с (1Н, NH).

Спектр ЯМР 13С, δ, м.д.: 26.12, 44.12, 88.59, 110.08, 122.64, 128.08, 128.78, 131.05, 131.81, 133.29, 140.64, 165.07, 166.24, 176.02, 207.75.

Заявляемое соединение представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в ДМФА, уксусной кислоте, при нагревании - в этиловом спирте, устойчивое при хранении. Далее проводили контроль степени чистоты соединения при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ). Степень чистоты составила более 98%.

Сравнение цитотоксической активности паклитаксела и 2-АБФПК было проведено по общепринятой методике: были приготовлены маточные растворы в ДМСО. Маточный раствор прототипа готовили следующим образом: 1 мг паклитаксела (Sigma-algrich T7191) в 1,17 мл ДМСО (Хеликон, Am-O231-0.1) с конечной концентрацией 1 мМ. 2-АБФПК растворяли также в ДМСО, маточный раствор готовили растворением 0,013 г 2-АБФПК в 1,25 мл ДМСО с конечной концентрацией 5 мМ и 10 мМ.

Паклитаксел и 2-АБФПК добавляли к культурам опухолевых клеток клеточных линий лейомиосаркомы (SK-LMS-1), рабдомиосаркомы (RD), фибросаркомы (НТ1080), остеосаркомы (U2OS), рака молочной железы (НСС1806), а также гастроинтестинальных опухолей (GIST).

Изобретение подтверждается следующими графическими материалами, на которых представлено:

На фиг. 1 - результаты световой микроскопии клеток гастроинтестинальной стромальной опухоли (GIST - T1-R) под действием 2-АБФПК и паклитаксела (положительный контроль) в течение 24 часов культивирования.

На фиг. 2 - уровень экспрессии расщепленной формы ПАРП в клетках ГИСО под действием 2-АБФПК, паклитаксела и винбластина.

При изучении морфологических изменений опухолевых клеток человека под действием 2-АБФПК было обнаружено изменение их формы. Опухолевые клетки приобретали округлую форму, что соответствует их селективному накоплению в митозе. Аналогичные изменения наблюдались при инкубации опухолевых клеток с прототипом паклитакселом (Фигура 1), относящихся к группе препаратов - "митотических ядов", вызывающих необратимую полимеризацию тубулина, остановку деления клеток в М-фазе клеточного цикла и последующий запуск апоптоза вследствие незавершенности процессов деления.

Методом колориметрического MTS-теста была выявлена половинная ингибирующая доза (IC50) для 2-АБФПК в отношении разных опухолевых клеточных линий и нетрансформированных фибробластов человека (Табл. 1). Важно отметить, что цитотоксичность данного соединения была существенно выше в отношении большинства исследованных опухолевых клеточных линий (за исключением остео- и фибросаркомы) по сравнению с нетрансформированными клетками, что может свидетельствовать о потенциально высоком "терапевтическом окне" у исследуемого соединения. Важно также отметить, что соединение было также эффективным в отношении опухолевых клеток человека, резистентных к прототипу - паклитакселу, а также препаратам сравнения - иматинибу мезилату (см. Таблицу 1).

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Для дальнейшего исследования механизмов цитотоксической активности соединения АБФПК была исследована их способность индуцировать клеточную гибель по механизму апоптоза. С этой целью был проанализирован уровень экспрессии расщепленной формы поли-АДФ-рибоза-полимеразы (ПАРП), являющийся традиционным маркером программированной клеточной гибели. Для клеток ГИСО был показан дозозависимый про-апоптотический эффект соединения 2-АБФПК, аналогичный эффекту паклитаксела и превышающий таковой у винбластина. Уровень экспрессии расщепленной формы ПАРП в клетках ГИСО под действием 2-АБФПК, паклитаксела и винбластина представлен на Фигуре 2. Уровень экспрессии белка актина иллюстрирует равную белковую нагрузку в исследуемых образцах. Аналогичные данные были получены на других клеточных линиях ГИСО, сарком и рака молочной железы.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что 2-АБФПК оказывает цитотоксический эффект в отношении широкого спектра опухолевых клеток человека, индуцируя их гибель по механизму апоптоза.
Общая патология
Сергей
Бойчук
Васильевич
Заведующий кафедрой
Доктор медицинских наук
Профессор
-
-
РОССИЯ
Алексей
Созинов
Станиславович
Ректор
РОССИЯ
34.19.27
Цитопатология
03.01.TM
PATHOLOGY
Сергей
Бойчук
Васильевич
Руководство, разработка способа, апробация
РОССИЯ
Айгуль
Галембикова
Рафиковна
Руководство, разработка способа, апробация
РОССИЯ
ФГБОУ ВО КАЗАНСКИЙ ГМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1021602848189
АЛЕКСЕЙ
СОЗИНОВ
СТАНИСЛАВОВИЧ
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения