Разработка лекарственного кандидата противоопухолевого действия для профилактики и лечения онкологических заболеваний у животных
1-амино-3-(цианоарилиден)-3Н-изоиндолы Противоопухолевый и иммуностимулирующий эффекты Онкологические заболевания у животных
СОДЕРЖАНИЕ

Введение	1
1.	Анализ научной литературы.	3
2.	Разработка синтеза	3
3.	Подбор оптимальных условий, синтез серии соединений	5
4.	Достоинства метода	10
5.	Биологический скрининг	12
Заключение	16
Литература   17


Введение
В настоящее время стремительно растет спрос в ветеринарии на противоопухолевые препараты для животных. На рынке противоопухолевых средств находится несколько препаратов, которые на сегодняшний день используются для лечения новообразований у людей, но в тоже время являются перспективными в области ветеринарии, а именно, для лечения и профилактики онкологических заболеваний у животных. Многие их противоопухолевых препаратов для животных  обладают рядом недостатков: высокая токсичность, не избирательность раковых клеток, трудоемкие процессы их получения, а также низкая эффективность обособленного применения при лечении. В рамках НИР представляется возможным разработать лекарственный компонент, который является более специфичным для определенной группы клеток, имеет расширенный спектр действия и является более эффективным при лечении опухолей у животных, плюсом ко всему имеет меньшую себестоимость производства, по сравнению с лекарственными препаратами подобного действия.
Так, цель данного исследования - создание лекарственного кандидата противоопухолевого действия для профилактики и лечения онкологических заболеваний у животных.
Для выполнения поставленной цели на первом этапе сформулированы следующие задачи:
1.	Исследование способов синтеза биологически активных изоиндолов. 
2.	Исследование соединений на основе изоиндолов на предмет их противоопухолевой активности.
3.	Разработка методов синтеза 1- амино-3-(цианоарилиден)-3Н-изоиндолов.
4.	Тестирование лабораторного способа синтеза амино-3-(цианоарилиден) -3Н-изоиндолов.
5.	Исследование биологической активности серии соединений.
6.	Разработка базы данных противоопухолевых кандидатов на основе изоиндолов.
1.	Анализ научной литературы.
Изучив научную литературу, а также воспользовавшись базой данных Reaxys, было выяснено, что одностадийных методов получения изоиндолов из доступных реагентов нет.
Используя опыт, накопленный в лаборатории ЯГПУ им. К.Д. Ушинского по взаимодействию ароматических нитрилов с арилацетонитрилами, нами предложен способ получения изоиндолов, который описан в пункте 2. 
2.	Разработка синтеза
Проанализировав полученные данные, был разработан принципиально новый, экономически выгодный метод синтеза, который подразумевает проведение каскадной реакции ароматических фталонитрилов 1 с арилацетонитрилами 2 при нагревании в суперосновной среде с получением потенциальных противоопухолевых кандидатов 3 (Схема 3).
 
Схема 3. Взаимодействие ароматических фталонитрилов с арилацетонитрилами.
Но данная реакция может завершиться как образованием производного аминоакрилонитрила 3*, так и производного изоиндола 3. Для определения структуры выделенного продукта реакции были получены данные ЯМР 1H, ЯМР 13C, ИК-спектроскопии, масс – спектрометрии и корреляционного NOESY спектра. 
 
Рисунок 1. ЯМР 1Н спектр (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрила.
На спектре ЯМР 1Н видны сигналы от растворителя (DMSO) 2,5 м.д. и H2O 3,25, а также сигналы ядер химически различающихся 11 атомов водорода. Отчетливые пики при 8,67 и 8,74 м.д. с интегральной интенсивностью соответствующей двум атомам водорода подтверждает наличие двух -NH групп в исследуемом соединении, а сигналы, расщепленные на двуплеты, триплеты и мультиплеты, относятся к 9 атомам водорода двух бензольных колец.
 
Рисунок 2. ЯМР 13С спектр ЯМР 1Н спектр (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрила.
На представленном спектре ЯМР 13С сигналы в области 120 – 140 м.д. соответствуют углеродам, находящимся в бензольных кольцах и цианогруппы, сигналы 160,46 и 169,23 м.д. соответствуют атомам углеродов гетероцикла, связанных с атомом азота, а пик сигнала с отметкой 93,06 соответствует углероду, связанному с цианогруппой.
Также для подтверждения структуры были сняты масс- и NOESY-спектры, которые с точностью позволяют сказать, о том, что полученное соединение представляет собой (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрил.
3.	Подбор оптимальных условий, синтез серии соединений
Протекание каскадной реакции, с образованием целевых (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрилов (схема 3) позволило изучить влияние условий протекания процесса на его закономерности и оптимизацию условий взаимодействия фенилацетонитрила с фталонитрилом. Оптимизацию проводили с помощью варьирования оснований, растворителей и температуры процесса, соотношения которых представлены в таблице 1. 
Таблица 1
Влияние условий процесса на выход (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрила (0.01 моль фталонитрила, 0.01 моль фенилацетонитрила)
 

№	Основа-ние	Растворитель	m(основания)/ V(растворителя)	Темп-ра,
оС	Время (ч)	Выход,  (%)
1	(C2H5)3N	ДМСО	5/15	70 – 80oC	16 ч	29%
2	K2CO3	ДМСО	5/15	70 – 80oC	16 ч	Сложная смесь
3	KOH	ДМСО	5/15	70 – 80oC	16 ч	59 %
4	NaOH	ДМСО	5/15	70 – 80oC	6 ч	35 %
5	NaOH	ДМСО	5/15	70 – 80oC	16 ч	96 %
6	(C2H5)3N	ДМФА	5/15	70 – 80oC	16 ч	37%
7	K2CO3	ДМФА	5/15	70 – 80oC	16 ч	Сложная смесь
8	KOH	ДМФА	5/15	70 – 80oC	16 ч	63%
9	NaOH	ДМФА	5/15	70 – 80oC	16 ч	77%
10	NaOH	Толуол/ТБАБ	5/15	80 – 90oC	16 ч	Сложная смесь
11	NaOH	Пропанол-2	4/15	70 – 80oC	16 ч	Сложная смесь
12	NaOH	ДМСО	4/15	70 – 80oC	24 ч	66 %
13	NaOH	ДМСО	5/5	70 – 80oC	16 ч	76 %
14	NaOH	ДМСО	5/5	20 oC	24 ч	-
15	NaOH	–	5/-	70 – 80oC	24 ч	следы

Из таблицы видно, что для образования (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрила необходимо наличие сильного основания, апротонного полярного растворителя и нагрев, а наилучшими условиями для протекания целевой реакции являются NaOH/ДМФА и NaOH/ДМСО, температура 70 – 80oC, время 16 ч. При использовании K2CO3 целевая реакция не протекает, а преобладают побочные процессы. Использование условий межфазного катализа, слабого основания в ДМФА или ДМСО, а также спиртового раствора щелочи приводит к образованию сложных неразделимых смесей. При проведении реакции в отсутствие растворителя наблюдается образование только следовых количеств, а при отсутствии нагревания реакция вообще не протекает.
С помощью данного метода (схема 3) и на основании оптимальных условий получена серия потенциальных биологически активных субстанций. Результаты синтеза представлены в таблице 2 и на схеме 6.

 
Схема 6. Синтез серии производных 3-иминоизоиндолин-1-илиденов в оптимальных условиях.
Структуры полученных соединений полностью совпадают с данными ЯМР 1Н, 13С – спектроскопии, а также масс-спектрами для некоторых соединений, что представлено в таблице 2.
Таблица 2
Строение и идентификация соединений
№	R1	Тпл.,оС	Цвет	Данные ЯМР 1H спектра	Масс-спектр, m/z
2a	С4Н4	227оС	бордовый	δ 7.96 – 7.89 (m, 2H), 7.85 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.3, 1.5 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.58 – 7.48 (m, 2H), 7.48 – 7.41 (m, 2H), 7.32 – 7.26 (m, 2H), 7.20 (tt, J = 7.6, 1.5 Hz, 1H), 1.50 (s, 2H).	-
2b	O-CH3	205 – 207℃	жёлтый	δ 8.60 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.38 (dd, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 8.31 – 7.96 (m, 2H), 7.94 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.72 – 7.57 (m, 1H), 7.57 – 7.46 (m, 1H), 7.17 – 6.81 (m, 2H), 4.22 – 3.42 (m, 3H).	260 – (M+-O-CH3), 232 – (M+-CH3N3), 205, 129 – (C10H8), 116 – (C9H7), 102 – (C6H5CN), 76 – (C6H5)
2c	Cl	237℃	бежевый	δ 8.86 (d, J = 37.7 Hz, 2H), 8.43 – 8.37 (m, 2H), 7.97 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 7.66 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.58 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.45 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H).	278 – (М+-NH2), 244 – (М+-СН3Cl), 215 – (M+-CN), 122, 102, 95
2d	H	200	жёлтый	δ 8.68 (d, J = 41.4 Hz, 2H), 8.41 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 8.15 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.67 – 7.53 (m, 2H), 7.41 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 7.0 Hz, 1H).	-
2e	CH3	215 – 217℃	жёлтый	δ 8.60 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.38 (dd, J = 7.7, 2.4 Hz, 1H), 8.31 – 7.96 (m, 2H), 7.94 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.72 – 7.57 (m, 1H), 7.57 – 7.46 (m, 1H), 7.17 – 6.81 (m, 2H), 6,92 – 7,23 (m, 3H).	258 – (М+-H), 244 – (М+-СН3), 233 – (М+-NH2), 129 – (M+-C5H4N2), 102 – (C6H5CN), 77 – (C6H5) 
Соединения, описанные в статье [1] отличаются противоопухолевой активностью по отношению к гепатоцеллюлярной карциноме. Все синтезированные нами соединения, так же, как и соединения, описанные в статье [1] имеют акрилонитрильный фрагмент, что позволяет выдвинуть гипотезу о том, что синтезированные соединения являются потенциальными противоопухолевыми агентами.
Также, синтезированные соединения были проанализированы на биологическую активность и выяснено, что анализ полученных спектров биологической активности с помощью компьютерной программы PASS, показал, что для большинства синтезированных соединений прогнозируется антиангинальная и противоишемическая активность, данные приведены в таблице 3.
Таблица 3
Прогнозируемые фармакологические эффекты для полученных соединений (2a – 2e).
Pa	Pi	Наименование проявляемого эффекта
0,903 – 0,932	0,002 – 0,003	Aнтиангинальный (2a, 2b, 2c, 2e)
0,842 – 0,901	0,003 – 0,004	Противоишемический (2a, 2b, 2c, 2e)
0,747 – 0,811	0,004	Лечение ишемии миокарда (2d, 2a)
0,736 – 0,746	0,021 – 0,023	Антиишемический, церебральный (2c, 2d)
0,743	0,050	Ингибитор аспульвинон-диметилаллилтрансферазы (2b)
0,891	0,007	Лечение фобических расстройств (2d)
0,800	0,005	Противоаллергические (2d)
0,798	0,007	Ингибитор фактора дополнения D (2d)
0,787	0,004	S-алкилцистеиновый ингибитор лиазы (2d)
0,788	0,014	НАДФН, ингибитор пероксидазы (2d)
0,782	0,007	Веномбин ингибитор АБ (2d)

Но даже не увидев в списке противоопухолевой активности, не стоит делать вывод о том, что синтезированные соединения не могут проявлять противоопухолевую активность, так как это не научный эксперимент, а виртуальная база данных, где даже для уже существующих противоопухолевых компонентов, например индол-3-карбинола, не прогнозируется противоопухолевая активность. Эти данные необходимы для того, что понять есть ли перспективность биологической активности данных соединений, как мы видим из таблицы 3, перспективность использования соединений в качестве компонентов лекарственные препаратов есть, и весьма неплохая. 
4.	Достоинства метода
Разработанный по схеме 3 метод синтеза имеет ряд достоинств, во – первых он является экономически выгодны, а во – вторых данный метод позволяет получать целевые соединения с высокими выходами и чистотой соединений, что подтверждается ЯМР-спектроскопией. 
Экономически выгодным синтез проходящий по схеме 3 является потому как, 1 кг фталонитрила стоит в среднем 90$, также в синтезе задействованы легкодоступные и недорогостоящие реактивы, например растворители такие как ДМСО, основания  NaOH и другие. Тем самым выход целевого продукта в зависимости от заместителей составляет 600-1000$, что дешевле примерно в 5 раз, чем синтез уже существующих противоопухолевых компонентов (на схеме 4 изображен метод синтеза с ценовыми показателями).  
 
Схема 4. Разработанный метод синтеза с ценовыми показателями.
В тоже время синтез уже известных противоопухолевых компонентов, например индол-3-карбинола является значительно экономически затратным и невыгодным, потому как основной реагент индол-3-карбальдегид в среднем за 1 кг стоит 2350$, а целевой продукт – 5000$ (Схема 5). 
 
Схема 5. Синтез индол-3-карбинола.
Ещё одним достоинством является выход целевых соединений, который составляет от 57% до 96%, более подробные числовые значения приведены в таблице 4.
Таблица 4
Выходы целевых продуктов
Соединение, №	Выход, %	Соединение, №	Выход, %
2a                                67%	           2d                    96%
2b                                70%	           2e                    57%
2c                                86%
Применение данного метода позволило региоселективно и с высокими выходами получить целевые соединения, при этом не прибегая к дорогостоящим реагентам и растворителям.  
Наиболее высокие выходы наблюдались при таких заместителях как –Cl, -O-CH3, наименьшие же выходы были получены в реакции с такими заместителями как –CH3  и Nf(нафтил).
5.	Биологический скрининг
Так как противоопухолевый скрининг хорошо коррелируется с антибактериальной активностью, и почти всегда эти активности соответствует друг другу, был проведен скрининг на антибактериальную активность.  Основным источником при разработке методики проведения биологического скрининга стали данные [2]. 
Методика приготовление питательных сред:
На магнитную мешалку поместить 2 литровую колбу, снабженную магнитным мешальником. В колбу загрузить 20 г питательного бульона и 1 л свежедистиллированной воды, растворить бульон при нагревании иинтенсивном перемешивании. Кипятить суспензию в течение одной минуты до полного растворения. Разлить полученный раствор в чистые контейнеры подходящего размера и стерилизовать в автоклаве при 121 °C в течение 15 минут. Готовая среда, прозрачно-янтарного цветахранится при температуре 2-8 °C. В случае каких-либо физических изменений следует отказаться использования от среды.
Методика культивирования микроорганизмов: 
Для культивации штаммов тест-культур во всех случаях был использован LB-бульон. Культивацию проводили в стерильных пробирках и колбах с ватно-марлевыми пробками, чашках Петри с аэрацией при температуре 37°C. 
Методика: Снять бактериологической петлей одиночную бактериальную колонию с чашки с LB-агаром, инкубированной при 37 °С в течение 16—20 ч, и переносят ее в пламени горелки в стерильную колбу, содержащую 10 мл LB-бульона. Полученный раствор инкубируют при 37 °С и сильной аэрации (200 об/мин) (либо в ее отсутствие) в течение ночи. 
Приготовление разведений препаратов.
Метод 1. (водный раствор)
2,56 мг Препарата растворяли в 50 мкл дистиллированой воды, Раствор исследуемого соединения вносили в 4 мл одноразовые кюветы для спектрофотометра и производили последовательное двукратное разведение стерильным раствором LB. Полученные разведения препарата: 8-16-32-64-128-256 мкг/мл. 
Метод 2. (Раствор в ДМСО)
2,56 мг препарата растворяли в 50 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), 
Наблюдали образование гомогенного раствора. Раствор исследуемого соединения вносили в 4 мл одноразовые кюветы для спектрофотометра и производили последовательное двукратное разведение. Полученные разведения препарата: 8-16-32-64-128-256 мкг/мл. 
Готовили стерильные кюветы с контролем питательной среды/«бланк» и выдерживали в холодильнике при температуре +4°С в течение времени эксперимента. Кюветы с контролем роста рабочей суспензии (1% контроль) помещали в инкубатор при 37 С.
Инокуляция бактериальной суспензии. Рабочую суспензию культуры микроорганизмов с примерной концентрацией 106 КОЕ/мл в объеме 500 мкл вносили в кюветы. Конечный объем внесенной жидкости во всех кюветах – 1 мл. После внесения всех компонентов кюветы закрывали стерильными крышками, затем измеряли оптическую плотность полученной суспензии на спектрофотометре. Кюветы инкубировали в течение 16-20 ч в термостате при температуре +37 °С. 
Регистрация роста бактериальной культуры. По окончании инкубации рост бактерий регистрировали турбидиметрическим методом по изменению оптической плотности суспензии с помощью спектрофотометра (длина волны излучения – 625 нм).
Расчет МИК. Вычисляли средние значения показателя оптической плотности суспензии за вычетом величины исходного светопропускания раствора (до инкубации) в каждой тестовой кювете: 1)отрицательного контроля роста рабочей суспензии, содержащего референсный антибиотик в концентрации, равной минимальной концентрации исследуемых веществ; 2) контроля, содержащего бактериальную суспензию с концентрацией микроорганизмов 5*105 КОЕ/мл; 3) каждой концентрации исследуемого вещества. По полученным данным оптической плотности строили график зависимости активности от концентрации препарата.  Минимальной ингибирующей концентрацией считали концентрацию препарата, в которой среднее значение светопропускания суспензии значимо не превышало 1% среднего значения контроля роста и/или точку выхода кривой на «плато». 
На штаммах грамм-отрицательных и грамм-положительных бактериях E.coli C600 и St.aur. ATCC-25923 были выявлены 3 соединения-кандидата из (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиденов, которые показали наиболее высокую антибактериальную активность (Таблица 5). 
Таблица 5
База активных антибактериальных агентов
№ п/п	Формула соединения	МИК E.coli C600, мкг/мл	МИК St.aur. ATCC-25923, мкг/мл
2a	                                                        64	                                                  128
2b	                                                        256	                                                  256
2c	                                                        32	                                                  64
2d	                                                       128	                                                  256
2e	                                                        64	                                                  128
Как видно из представленных выше данных антибактериальную активность в отношении E.coli (С600) и St. aureus (ATCC-25923) проявили соединения с такими заместителями, как –CH3, -Cl, -Nf.

Заключение
1.	С помощью каскадной реакции фталонитрила с арилацетонитрилами разработан новый метод синтеза получения противоопухолевых кандидатов (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиден)-2-фенилацетонитрилов и его замещённых аналогов.
2.	Проведена оптимизация условий, и выбраны наилучшие условия для протекания целевой реакции, это NaOH/ДМСО, температура 70 – 80oC, время 16 ч, с помощью которой был синтезирован весь ряд соединений.
3.	Синтезирована серия потенциальных противоопухолевых соединений-кандидатов на основе (E)-2-(3-иминоизоиндолин-1-илиденов).
4.	Проведён анализ спектров биологической активности в программе Pass Online, который показал наличие потенциальной и наиболее вероятной антиангинальной и противоишемической активности.
5.	Разработана методика проведения биологического скрининга, которая позволила изучить антибактериальные свойства синтезированных соединений.
6.	Изучены антибактериальные свойства синтезированных соединений в среде E.coli (С600) и St. aureus (ATCC-25923), и на основании этого выявлено 3 соединения-лидера
Литература
1.	Salimeh Amidi , Zahra Hashemi, Abbasali Motallebi, Melika Nazemi, Hoda Farrokhpayam, Enayatollah Seydi  and Jalal Pourahmad, Identification of (Z)-2,3-Diphenylacrylonitrile as Anti-Cancer Molecule in Persian Gulf Sea Cucumber Holothuria parva // Mar. Drugs 2017, 15(10). p. 314.
2.	Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов в антибактериальным препаратам МУК 4.2.1890-04
Разработанный продукт будет использован в качестве действующего компонента нового лекарственного препарата для лечения онкологических заболеваний у животных. Продукт будет востребован у компаний занимающихся производством инновационных лекарственных и ветеринарных препаратов, а также их распространением. Данная продукция может быть применена в области ветеринарии, фармацевтики и медицинской химии.
Александр
Котов
Дмитриевич
Заведующий кафедрой ХТиМПХ ЯГПУ им. К.Д. Ушинского
Доктор химических наук
Профессор
-
-
РОССИЯ
Анастасия
Григорьева
Игоревна
Аспирант
РОССИЯ
31.27.31
Биохимия опухолей
01.04.EE
CHEMISTRY, ORGANIC
Анастасия
Григорьева
Игоревна
Выполнение всех экспериментальных работ, описание полученных результатов, заполнение отчётности, выступления на конференциях.
РОССИЯ
Александр
Котов
Дмитриевич
Отвечает за достижение целей, обеспечение проекта ресурсами, сопровождение документации проекта
РОССИЯ
ФОНД СОДЕЙСТВИЯ ИННОВАЦИЯМ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ФОНД СОДЕЙСТВИЯ РАЗВИТИЮ МАЛЫХ ФОРМ ПРЕДПРИЯТИЙ В НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ СФЕРЕ"
1027739479734
Организация
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере"
Федеральные государственные бюджетные учреждения
Анастасия
Григорьева
Игоревна
Физическое лицо
РОССИЯ