Спиропроизводное пиразолидиндиона-3,5, обладающее противомикробными свой-ствами, и способ его получения
спиропроизводное пиразолидиндиона-3,5, циклобутандикарбоновая кислота, спектральные характеристики соединений.
Спиропроизводное пиразолидиндиона-3,5, обладающее противомикробными свой-ствами, и способ его получения
Авторы изобретения: Семенов А.В., Семенова Е.В., Зульфугаров П.К, Зубарев А.А.

Реферат:
Изобретение относится к спиропроизводным пиразолидиндиона-3,5, к способу полу-чения, а также противомикробному свойству для применения в медицинской практике для борьбы с инфекционными заболеваниями. 
Технический результат: описано спиропроизводное пиразолидиндиона-3,5 (6,7-бис(4-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8), который обладает противомикробны-ми свойствами и может быть использован для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в терапии и профилактике инфекционных заболеваний.
Спиропроизводные пиразолидиндиона-3,5 представляют собой потенциально новый класс синтетических антимикробных средств, которые ранее не применялись для лечения инфекционных заболеваний. Ввиду чего следует ожидать минимальный уровень вторичной резистентности, что позволит применять их в том числе для лечения внутрибольничных ин-фекционных заболеваний, вызываемых полирезистентной бактериальной флорой. 
Синтез спирогетероциклических производных путем кипячения в течение 6 ч смеси хлорангидрида с соответствующим 1,2-диарилгидразином в среде сухого бензола в присут-ствии каталитических количеств безводного пиридина. В рамках указанной схемы было по-лучено несколько соединений продуктов, выделенных в чистом виде (химическая структура приведена на рисунке). Выделение соединений проводилось дробной кристаллизацией из этанола. Из указанных соединений по результатам микробиологического исследования наиболее значимой активностью обладало вещество 6,7-бис(4-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8.
 
Спектры ЯМР 1H и 13C записаны на спектрометре Bruker AM 400 (400.130 и 75.468 MГц соответственно) для растворов веществ в ДМСО-d6. Внутренний стандарт  ГМДС.
ИК-спектры получены на спектрометре ИНФРАЛЮМ ФТ-02 в таблетках KBr или тонком слое.
Условия аналитической ТСХ: адсорбент – Sorbfil ПТСХ-АФ-А, элюент – гексан – эфир, 1:1.
Бензин, эфир, бензол, этиловый спирт и другие растворители, используемые в реак-циях, очищали по описаниям, представленным в руководстве.

Далее приведено подробное описание методов получения исходных веществ и про-межуточных соединений, использованных для синтеза спиропроизводных пиразолидиндио-на-3,5.
Получение дибутилового эфира циклобутандикарбоновой кислоты (2)
В трехгорлую колбу, снабженную обратным холодильником и механической мешал-кой, помещали 850 мл бутанола, нагревали на масляной бане и растворяли 52 г (2,3 моль) металлического натрия, затем медленно прибавляли  203 г (192 мл, 1, 3 моль) малонового эфира, температура ба-ни 90˚С. В течение 30 мин к реакционной смеси прибавляли 158,5 г (1 моль) 1-хлор-3-бромпропана. Перемешивание и нагревание продолжали в течение 2 ч, после чего растворитель отгоняли. Остаток при охлаждении растворяли в воде, подкисляли соляной кислотой до нейтральной реакции, экстрагировали смесью эфир – бензол. Органи-ческие вытяжки сушили безводным MgSO4, отгоняли растворитель в вакууме водоструйного насоса. Остаток перегоняли в вакууме, собирая фракцию с т. кип. 110 – 115 ˚С / 1 мм. рт. ст.
Получение циклобутандикарбоновой кислоты 
В круглодонной колбе готовили раствор 27 г (0,48 моль) гидроксида калия в 70 мл этанола. К полученному раствору небольшими порциями при перемешивании и охлаждении в бане с водой прибавляли 62 г (0,24 моль) дибутилового эфира циклобутандикарбоновой кислоты. Постепенно образовывался белый густой осадок калиевой соли кислоты. Колбу с осадком нагревали на водяной бане с обратным холодильником 2 ч. Растворитель отгоняли в вакууме водоструйного насоса на водяной бане. Остаток сушили под вакуумом, нагревая на водяной бане. Прибавляли примерно 70 мл горячей воды до растворения осадка. Раствор охлаждали до комнатной температуры. Нейтрализовали концентрированной НСl до кислой реакции. При этом образовался белый осадок кислоты. Для более полного извлечения про-дукта, водный раствор экстрагировали эфиром (5 х 50 мл). Объединенные вытяжки сушили CaCl2 и отогнали растворитель. После кристаллизации из этилацетата общий выход кисло-ты составил 7,6 г (30 %). Т. пл. 155-160ºС.
Получение хлорангидрида циклобутандикарбоновой кислоты
В круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой помещали 30 г (0.21 моль) циклобутандикарбоновой кислоты и 29 мл (28 г, 0,20 моль) SO2Cl2. Реакционную смесь нагревали на водяной бане в течение 36 ч при 40ºС, а за-тем при 60ºС до прекращения выделения газообразных продуктов (около 2 ч). Образовав-шуюся в результате свело-коричневую жидкость перегоняли под вакуумом водоструйного насоса, собирая фракцию с т. кип. 95–100 ºС (15 мм. рт. ст.). Получили 32 г хлорангидрида в виде бесцветной жидкости. Выход 84%. 
ИК спектр соединения (ν, см–1, тонкий слой): 3008 сл., 2962 сл., 1782 оч. с. (С=О), 1134 с., 1029 ср., 956 с., 921 с., 810 с., 729 с, 447 ср.  
Получение пара-нитрохлорбензола
В трехгорлую колбу, снабженную обратным холодильником, механической мешал-кой и капельной воронкой, поместили 35 г (0,3моль) хлорбензола. При нагревании на водя-ной бане (25–35оС) и постоянном перемешивании постепенно прикапывали смесь 21,9 г азотной кислоты (ρ=1,5) и 44 г концентрированной серной кислоты. Реакционную смесь пе-ремешивали 3 ч при комнатной температуре, а затем еще 2 часа при 50 оС. После охлажде-ния образовавшийся осадок отфильтровали и промыли небольшим количеством ледяной во-ды. Продукт очищали двукратной кристаллизацией из воды. Выход пара-нитрохлорбензола составил 26,5 г (55% ). Т. пл. 83-84ºС. 
Получение диазенокида
В круглодонной колбе, снабженной механической мешалкой растворили 5 г (31 ммоль) 3,4-дихлоранилина в 60 мл метанола. К полученному раствору прибавили  0,35 г (3 ммоль) оксида селена (IV) и 9 мл 30 %-го водного раствора пероксида водорода.  Смесь пе-ремешивалась 11 часов при комнатной температуре. Об окончании реакции судили методом ТСХ по исчезновению пятна исходного соединения. Растворитель удаляли в вакууме. Оста-ток растворяли в смеси 50 мл CH2Cl2 и 20 мл воды. Водную фазу насыщали NaCl  и экстра-гировали CH2Cl2 (2 х 30 мл). Объединенные органические вытяжки сушили MgSO4. После удаления растворителя получили продукт в виде желто-коричневого осадка. Масса продукта 3,8 г (выход 75%). Диазенокид очищали кристаллизацией из этанола.
1,2-Бис(3,4-дихлорфенил)диазеноксид: Т. пл. 145–149 ºС. Спектр ИК (ν, см–1, KBr):  3101 с., 1458 оч. с. (N=NO), 1304 ср., 1207 ср., 1130 ср., 1026 ср., 895 ср., 817 ср, 706 сл., 590 сл.
Получение 1,2-диарилгидразинов. Общая методика
В плоскодонной колбе, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильни-ком, растворяли 3 г (19 ммоль) соответствующего нитро-бензола или 6 г (18 ммоль) диазе-ноксида.  К полученному раствору небольшими порциями при перемешивании прибавляли 3 г (114 ммоль) алюминиевой пудры и 6,3 г ( 114 ммоль) гидроксида калия. Наблюдалось разогревание реакционной смеси до закипания растворителя и постепенное появление жел-то-оранжевой окраски. Смесь перемешивали в течение 10 минут до прекращения кипения растворителя и добавляли аликвоту Al-KOH-метанол (равную первому добавленному коли-честву). Перемешивали еще 10 мин. Об окончании реакции судили по исчезновению окрас-ки. Продукт экстрагировали диэтиловым эфиром (3 х 10 мл) Собранные органические вы-тяжки  промывали  0.1 М HCl и водой и сушили MgSO4. Растворитель отгоняли. Получали соответствующие гидразины в виде желтоватых или желто-оранжевых кристаллов быстро окисляющихся на воздухе. 
1,2-Дифенилгидразин: Т. пл. 126 – 127 ºС. Спектр ИК (ν,  см–1,  KBr):  3332 с. (NH), 1596 оч. с., 1481 оч. с., 1245 ср., 1168 сл., 1072 сл., 807 сл., 752 оч. с., 694 с, 513 сл.
1,2-Бис(2-хлорфенил)гидразин: Т. пл. 85 – 86 ºС. Спектр ИК (ν,  см–1,  KBr):  3350 с. (NH), 2972 сл, 1594 оч. с., 1473 оч. с., 1245 ср., 1143 сл., 1057 сл., 808 сл., 752 ср., 692 с, 534 сл.
1,2-Бис(4-хлорфенил)гидразин: Т. пл. 120 – 122 ºС. Спектр ИК (ν, см–1, KBr):  3330 с. (NH), 2968 сл., 1594 оч. с., 1462 оч. с., 1250 ср., 1138 сл., 1031 сл., 810 сл., 732  ср., 684 с, 570 сл.
1,2-Бис(3,4-дихлорфенил)гидразин: Т. пл.  ºС. Спектр ИК (ν, см–1, KBr):  3337 ср. (NH), 2964  с., 2924 с., 1593 оч. с., 1466 оч. с., 1261 ср., 1120 с., 1018 с., 817 ср., 644 ср.
Получение 1,2-дифенилпиразолидиндиона-3,5 
В круглодонной колбе с обратным холодильником, снабженным хлоркальциевой трубкой готовили раствор этилата натрия растворением 0,35 г (15 ммоль) металлического натрия в 10 мл абсолютного этанола. К полученному раствору добавляли 1,5 г (7,9 ммоль) 1,2-дифенилгидразина и 1,3 г (7,9 ммоль) малонового эфира. Смесь медленно нагревали на масляной бане и отгоняли этанол. После удаления растворителя остаток выдерживали 2 часа при температуре 190 – 210 оС. После охлаждения остаток растворяли в горячей воде, рас-твор отфильтровывали, охлаждали и подкисляли разбавленной соляной кислотой до кислой реакции. При дальнейшем охлаждении образовывался белый осадок соединения массой 1,7 г (выход 85%). Продукт очищали кристаллизацией из этанола. Т. пл. 179-180оС.
Получение сприросоединений. Общая методика
	В круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой, ка-пельной во-ронкой и обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, помещали 13 ммоль соответ-ствующего диарилгидразина и 2,4 мл (29 ммоль) сухого пиридина в 48 мл сухого бензола. К раствору при перемешивании медленно прикапывали 2,15 г (11 ммоль) хлорангидрида. Ре-акционную смесь перемешивали 30 мин при комнатной температуре, а затем еще 4 часа при кипячении. Реакционную смесь промывали разбавленной соляной кислотой и водой. Орга-ническую фазу сушили MgSO4. После удаления растворителя получали соответствующие продукты (1) – (4) которые очищали многократной кристаллизацией из этанола.  Данные о константах и выходах спиросоединений (1) – (4) представлены в табл. 1, а их спектральные характеристики в табл. 2.

Табл. 1. Константы и выход соединений (1) – (4)

№	Название	Т. пл., ºС	Rf	Выход, %
1	6,7-дифенил-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8	132–133	0,60	72
2	6,7-бис(2-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8	80–81	0,63	64
3	6,7-бис(4-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8	138–140	0,51	67
4	6,7-бис(3,4-дихлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8	133–134	0,42	56

Строение всех полученных соединений подтверждено спектральными методами (см. табл. 2). 
Так в спектрах ЯМР 1H спиропросоединений (1)–(3) присутствуют триплетные и мультиплетные сигналы в областях 2,20 – 2,50 и 1,80 – 2,15 м.д. соответственно, относящие-ся к водородным атомам циклобутанового кольца. 
Табл. 2. Спектральные характеристики соединений (1) – (4)

№	Спектр ЯМР 1Н, δ, м.д.	Спектр ЯМР 13С, δ, м.д.	Спектр ИК, ν, см–1
	H1,3	H4	Hаром	С1,3	С2	С4	С=О	Саром	С=О	С–N
1	2,49 т (4Н)	2,14 м (2Н)	7,18 м (2Н)
7,34 м (8Н)	28,7	16,4	47,1	173,1	123,4
127,0
129,2
136,5	1724	1299
2	2,22 т (4Н)	1,92 м (2Н)	7,17 т (2Н) 7,31 т (2Н) 7,47 д (2Н) 7,67 д (2Н)	29,0	16,5	61,0	174,8	129,9
130,1
131,3
133,1
136,0
139,7	1658	1292
3	2,22 т (4Н)	1,86 м (2Н)	7,38 д (4Н)
7,56 д (4Н)	28,9	16,4	58,3	174,2	129,0
132,9
133,3
134,1	1643	1269
4	–	–	–	–	–	–	–	–	1640	1261

В спектрах ЯМР 13С всех исследуемых образцов присутствуют три сигнала в области 16 – 61 м.д., обусловленные углеродными атомами циклобутанового фрагмента, шесть сиг-налов характеризующих углеродные атомы бензольных колец, и сильнопольный сигнал 173 – 175 м.д. характерный для карбольнильных углеродных атомов. 
В ИК спектрах производных (1) – (4) фиксируются интенсивные сигналы в области 1640 – 1725 см–1, обусловленные характеристическими колебаниями с участием групп С=О, и высокоинтенсивные сигналы в области 1260– 1300 см–1, характерные для валентных коле-баний связей С–N.
Микробиологические исследования
В достаточном количестве для микробиологического исследования были получены вещества (1), (2), (3). Для них и проводился противомикробный скрининг по общепринятой методике методом серийных разведений. Минимальные ингибирующие концентрации представлены в таблице 3.
Таблица 3. Минимальная ингибирующая концентрация (мкг/мл)
Микроорганизм	Соединение
	1	2	3
Staphyloccocus aureus	500	> 1000	125
Escherichia coli	> 1000	> 1000	> 1000
По результатам противомикробного скрининга все вещества проявляли низкую ак-тивность в отношении стандартного штамма Escherichia coli, но вещества (1) и (3) проявля-ли высокую активность в отношении  клинического штамму Staphyloccocus aureus. N – хлорсодержащее соединение (3) было в четыре раза активнее других исследуемых соедине-ний.

Таким образом, было получено спиропроизводное пиразолидиндиона-3,5 (6,7-бис(4-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8), обладающие противомикробным действием в отношении в отношении золотистого стафилококка (S. aureus).
Формула изобретения 

1.	Спиропроизводное пиразолидиндиона-3,5 - 6,7-бис(4-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8 - обладающие противомикробными свойствами в отношении золотистого стафилококка (S. aureus).
2.	Способ синтеза спиропроизводных пиразолидиндиона-3,5 включает кипячение в течение 6 ч смеси хлорангидрида с соответствующим 1,2-диарилгидразином в среде сухого бензола в присутствии каталитических количеств безводного пири-дина с последующем выделением путем дробной кристаллизации в этаноле про-изводного 6,7-бис(4-хлорфенил)-6,7-диазаспиро[3.4]октандион-5,8.
3.	Способ подтверждения противомикробной активности заключается в оценке ви-димого помутнения в среде с патогенным микроорганизмом (S. aureus). в серий-ных разведениях.
Медицина, биология, биохимия, биотехнология.
Полад
Зульфугаров
Киримханович
Руководитель
Отсутствует
Отсутствует
"-"
"-"
отсутствует
РОССИЯ
Полад
Зульфугаров
Киримханович
Руководитель
РОССИЯ
76.31.35
Фармхимия
03.01.DX
CHEMISTRY, MEDICINAL
Полад
Зульфугаров
Киримханович
Разработка и синтез спиропроизводных пиразолидиндиона - 3,5. Первичный антимикробный скриннинг полученных образцов.
РОССИЯ
Полад
Зульфугаров
Киримханович
Физическое лицо
РОССИЯ
Полад
Зульфугаров
Киримханович
Физическое лицо
РОССИЯ