Способ создания экспериментальной модели грибкового кератоувеинта
конъюнктивальная поверхность грибковый кератоувеит роговица
Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Осуществляют аппликацию смоченным в 5% спиртовом растворе формалина стерильным диском из гемостатической губки размером 10×10 мм под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина. Надевают мягкую контактную линзу на 24 часа, на следующий день снимают мягкую контактную линзу и диск гемостатической губки. Далее на поверхность роговицы в течение 3 дней инстиллируют 0,1% раствор дексаметазона 4 раза в сутки, на 3-й день под местной инфильтрационной анестезией производят скарификацию эпителия роговицы размером 10×10 мм. После скарификации инсулиновым шприцем с интегрированной иглой 29G производят интрастромальную инъекцию 0,1 мл 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. Затем инстиллируют 2-3 капли 99% концентрата димексида, промывают роговицу и конъюнктивальную полость 0,1% раствором дексаметазона. После чего осуществляют орошение конъюнктивальной поверхности и роговицы 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия. Далее на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы наносят 0,2-0,3 мл этой же суспензии, надевают мягкую контактную линзу на роговицу. В последующие дни через 1 день за 5-6 подходов проводят дополнительные процедуры заражения роговицы, сняв мягкую контактную линзу, выполняют орошение 99% концентратом димескида, свежей клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. 106 КОЕ/мл совместно с интрастромальной инъекцией. Способ позволяет достоверно воспроизвести экспериментальную модель грибкового кератоувеита с изъязвлением роговицы у кроликов, не требует специального офтальмохирургического оборудования, при этом позволяет расширить возможность для исследования возникновения и течения патологического процесса и разработать местное этиологическое лечение. 1 пр., 6 ил.Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)


Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для моделирования грибкового кератоувеита с формированием язвы роговицы у кроликов в экспериментальных условиях с целью изучения механизмов происхождения и течения патологического процесса и разработки метода медикаментозной терапии.

В литературе растет число сообщений об увеличении доли грибковых кератитов в структуре инфекционных воспалений роговицы. В то же время этиологическое лечение окуломикозов остается недоступным в большинстве стран, в том числе и в Российской Федерации. [Давлетшина Н.И., Самойлов А.Н. Эпидемиология и методы лечения грибковых кератитов. Вестник офтальмологии. 2020; 136(4): 138-145.]. Если предположить, что все случаи с отрицательным микробиологическим посевом являются грибковыми, ежегодная заболеваемость составит 1.480.916 случаев (1.036.641-1.925.191) [The global incidence and diagnosis of fungal keratitis. Accessed 01.09.21. https://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS1473-3099(20)30448-5/fulltext].

Разработка эффективных и безопасных лекарственных средств местного этиологического лечения кератомикозов является приоритетной задачей для борьбы с окуломикозами. Создание воспроизводимых экспериментальных моделей кератомикозов на животных несомненно необходимо для изучения механизмов заражения, течения патологического процесса и разработки методик лечения.

Модели in vivo с отработкой способа на экспериментальных животных наиболее точно отражают патологические исходы процесса, в то же время эти протоколы сложны для реализации и требуют строго соблюдения этических норм. Одна из основных проблем экспериментальной медицины - выбор вида животных, на которых будут проводиться исследования. Для изучения закономерностей грибкового процесса на глазах выбраны кролики. Все эксперименты in vivo, описанные в данной работе, одобрены локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» МЗ РФ (заседание №1 от 4 февраля 2020 года).

В литературе описано немало аналогов, содержащих разнообразные способы моделирования грибкового кератита у экспериментальных животных.

Известны современные способы создания грибковых кератитов в рамках эксперимента у животных при помощи инстилляции и интрастромальной инъекции суспензии грибковых изолятов с обеспечением условий для инвазии инфекционного агента и формирования воспаления, близкого к клиническому.

Из известных отечественных разработок стоит отметить способ достижения грибкового кератита у кроликов (Патент RU №2346338 С2, МПК G09B 23/28, A61F 9/00 - 10.02.2009, Бюл. №4). Производится скарификация эпителия всей поверхности роговицы, далее надевают на глаз предварительно инфицированную дрожжевыми грибами мягкую контактную линзу и сшивают веки на 3-8 суток. Заявленный метод позволял достичь клинической картины грибкового кератита с контролируемыми стадиями процесса.

Недостатком данного способа является травматичность процедуры, необходимость хирургической блефарорафии. Также нам не удалось достичь выраженной картины грибкового кератита по заявленной методике.

Аналогичным методом с интрастромальным введением инокулята является способ моделирования грибкового кератита у кроликов посредством интракорнеального введения 0,1 мл клеточной взвеси грибков (2,5 × клеток/мл) [Schreiber, W., Olbrisch, A., Vorwerk, С., Koenig, W., Behrens-Baumann, W. Combined topical fluconazole and corticosteroid treatment for experimental Candida albicans keratomycosis. Investigative ophthalmology & visual science, 44(6): 2634-2643].

Недостатком данного способа является слабая контагиозность грибков Candida albicans, также воспроизвести грибковый кератит по заявленной методике при выполнении только лишь инъекции с грибковой суспензией нам не удалось.

Заявленный метод инфицирования кандидозным кератитом, в котором предварительно производят инстиляции гентамицина сульфата 0,5% 2 раза в сутки или глазных капель хлорамфеникола 0,2% без консервантов. Суспензию грибов вводят непосредственно в роговицу через канюлю 27G [Rabbit Model of Candida Keratomycosis. M. Motschmann W. Behrens-Baumann. Handbook of Animal Models of Infection. Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy, 1999, Pages 697-707].

Недостатком данного способа является слабая контагиозность грибков Candida albicans, к тому же для нашей практики большее значение имеет Fusarium spp.

Известен «Способ создания экспериментальной модели грибкового кератита у кроликов» (Патент RU №2746647, МПК G09B 23/28 - 19.04.2021, Бюл. №11). Способ создания экспериментальной модели грибкового кератита у кроликов заключается в том, что под местной анестезией на роговицу накладывают смоченный в 5% спиртовом растворе формалина стерильный диск из гемостатической губки, надевают мягкую контактную линзу на 24 часа, на следующий день снимают мягкую контактную линзу и диск гемостатической губки, на поверхность роговицы в течение 3 дней инстиллируют 0,1% раствор дексаметазона 4 раза в сутки, на 3-й день под местной инфильтрационной анестезией производят скарификацию эпителия роговицы размером 10×10 мм, инстиллируют на роговицу 99% концентрат димексида, далее производится орошение конъюнктивальной поверхности 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия, на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы наносят 0,2-0,3 мл этой же суспензии, надевают мягкую контактную линзу на роговицу, в последующие дни через 1 день за 3-4 подхода производят дополнительное орошение роговицы, отодвинув мягкую контактную линзу, 99% концентратом димексида, свежей клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. 106 КОЕ/мл.

Данный патент принят за прототип.

Этот способ неоднократно воспроизведен в рамках экспериментального исследования, однако основным его недостатком является не достаточная глубина расположения инфильтрата, абсолютное самоизлечение у экспериментальных животных и низкий риск потери органа зрения. В клинической практике грибковые кератиты часто приводят к сквозному поражению стромы и перфорации роговицы.

В условиях эксперимента воспроизведение глубокого стромального поражения роговицы по известным методам оказалось трудоемким и безрезультативным. Нами была произведена скарификация эпителия роговицы и применение контактных линз. Необходимым условием для развития грибковой инфекции роговицы явились повреждение эпителия и локальная иммуносупрессия. По этой причине наша методика отличается однократным применением 5% спиртового раствора формалина и инстиляций дексаметазона на этапе подготовки к заражению, а также применением 99% концентрата димексида в момент орошения роговицы кролика клинической суспензией Fusarium spp, и, в отличие от изобретения-прототипа, интрастромальная инъекция 0,1 мл инокулята при каждом сеансе заражения. Таким образом, в 4-5 приемов был достигнут кератоувеит с изъязвлением роговицы у экспериментального животного, что делает результат клинически актуальным. Для приготовления инокулюма также, как и в прототипном способе, использованы чистые, пяти суточные культуры грибов Fusarium solani, выросшие на плотной питательной среде Сабуро. Инокулят предварительно растерт в ступке. В стерильном изотоническом растворе хлорида натрия приготовлена взвесь микроорганизмов с конечной плотностью 1,0×106 клеток/мл, что соответствует 0,5 MF (измерение денситометром согласно данным изготовителя стандартов мутности bioMerieux).

Задачей заявляемого изобретения является разработка достоверно воспроизводимой экспериментальной модели грибкового кератоувеита с изъязвлением роговицы у кроликов, не требующей специального офтальмохирургического оборудования, что позволит расширить возможности для исследования возникновения и течения патологического процесса и разработки местного этиологического лечения.

Техническим результатом заявленного изобретения является достоверно производимый грибковый кератоувеит с изъязвлением роговицы с применением клинической суспензии Fusarium spp.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина на роговицу накладывают смоченный в 5% спиртовом растворе формалина стерильный диск из гемостатической губки размером 10×10 мм, надевают мягкую контактную линзу на 24 часа, на следующий день снимают мягкую контактную линзу и диск гемостатической губки, далее на поверхность роговицы в течение 3 дней инстилируют 0,1% раствор дексаметазона 4 раза в сутки, на 3-ий день под местной инфильтрационной анестезией производят скарификацию эпителия роговицы размером 10×10 мм, особенность заключается в том, что инсулиновым шприцем с интегрированной иглой 29G производят интрастромальную инъекцию 0,1 мл 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., инстилируют на роговицу 2-3 капли 99% концентрата димексида, далее производится орошение конъюнктивальной поверхности 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия, на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзой наносят 0,2-0,3 мл этой же суспензии, надевают мягкую контактную линзу на роговицу, в последующие дни через 1 день за 5-6 подходов производят дополнительные процедуры заражения роговицы, сняв мягкую контактную линзу, орошая 99% концентратом димескида, свежей клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. 106 КОЕ/мл совместно с интрастромальной инъекцией.

Преимуществом приведенного алгоритма является достоверность воспроизведения патологического процесса, сравнимого с клиническим, малоинвазивные методы инъекций при помощи малотравматичных игл, осуществляемые под инстилляционной анестезией, результативности предварительной подготовки инстиляциями медицинских растворов.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следует из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием фигур, на которых показано:

Фиг. 1 - здоровая роговица экспериментального животного (кролик породы «советская шиншилла») перед началом экспериментального заражения;

Фиг. 2 - результат аппликации стерильной гемостатической губки в 5% спиртовом растворе формалина под мягкой контактной линзой в течение 1 суток: смешанная инъекция сосудов конъюнктивы, слизистое отделяемое, эпителиопатия, выраженный роговичный синдром;

Фиг. 3 - момент интрастромальной инъекции клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp.;

Фиг. 4 - вид роговицы под мягкой контактной линзой сразу после интрастромальной инъекции клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp., орошения поверхности роговицы этой же суспензией;

Фиг. 5 - Кератоувеит с изъязвлением роговицы у кролика в результате экспериментального заражения роговицы кролика клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. по описанной методике;

Фиг. 6 - Перфорация язвы роговицы у кролика в результате экспериментального заражения роговицы кролика клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. по описанной методике на 14-ый день от первой процедуры заражения.

Способ осуществляется следующим образом.

Производится экспозиция в 5% спиртовом растворе формалина диска размером 10×10 мм стерильной гемостатической губки. Под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина губка устанавливается на поверхность роговицы, надевается обычная мягкая контактная линза на 24 часа. На следующий день диск гемостатической губки и мягкая контактная линза удаляются. В течение последующих 3 дней производятся инстиляции 0,1% дексаметазона 4 раза в сутки в исследуемый глаз. На 3-ий день под местной инфильтрационной анестезией 0,4% оксибупрокаина производится скарификация эпителия стерильным микрохирургическим лезвием в оптической зоне 10×10 мм. Инсулиновым шприцем с интегрированной иглой 29G производят интрастромальную инъекцию 0,1 мл 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp. Инстилируется 2-3 капли 99% концентрата димексида. Выжидается 20-30 минут для испарения лишнего объема лекарственных средств. Промывание роговицы и конъюнктивальной полости 0,1% р-ром дексаметазона. Производится орошение конъюнктивальной поверхности 106 КОЕ/мл клинической суспензии грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия. На внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы наносится 0,2-0,3 мл этой же суспензии. Мягкая контактная линза надевается на роговицу. В последующие дни через 1 день в 5-6 приемов под местной анестезией производится дополнительное орошение поверхности роговицы клинической суспензией Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия, с предварительной инстиляцией 1 капли 99% концентрата димексида и 2-3 капель 0,1% дексаметазона. Дополнительно производится интрастромальная инъекция 0,1 мл суспензии Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия. В результате мероприятий на 10-12-ый день получают глубокий грибковый гипопион-кератоувеит с изъязвлением роговицы, на 14-ый день без лечения сформирована перфорация роговицы.

Изобретение направлено на устранение вышеописанных недостатков и достоверное воспроизведение грибкового кератоувеита с изъязвлением роговицы с причинением минимальных страданий экспериментальному животному.

Всего проведен эксперимент на 6 кроликах.

Способ поясняется следующим экспериментальным примером.

Пример 1.

Кролик (фиг. 1), у которого при культуральном исследовании мазков конъюнктивы и роговицы здорового глаза выявлен Aspergillus flavus 102 КОЕ/мл, Penicillium expansum 102 КОЕ/мл, S. aureus 101 КОЕ/мл, Enterobacteriaceae 101 КОЕ/мл. Роговица инфицирована по описанной методике.

На 1-й день производится экспозиция в 5% спиртовом растворе формалина диска размером 10×10 мм стерильной гемостатической губки. Под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина губка устанавливается на поверхность роговицы, надевается обычная мягкая контактная линза на 24 часа. На следующий день диск гемостатической губки и мягкая контактная линза удаляются.

После обработки роговицы 5% спиртовым раствором формалина развилась клиническая картина химического ожога конъюнктивы и роговицы: смешанная инъекция сосудов конъюнктивы, обильное слизистое отделяемое, эпителиопатия, выраженный роговичный синдром (фиг. 2). Бактериологический и микологический посев мазка отделяемого конъюнктивальной полости, забранного в этот день, роста микрофлоры не обнаружил, таким образом достигнуто асептическое воспаление.

В течение последующих 3 дней производятся инстиляции 0,1% дексаметазона 4 раза в сутки в исследуемый глаз. На 3-й день инстиляций дексаметазона под местной анестезией 0,4% оксибупрокаина проведена скарификация эпителия стерильным микрохирургическим лезвием в оптической зоне 10×10 мм. Инсулиновым шприцем с интегрированной иглой 29G произведена интрастромальная инъекция 0,1 мл 106 КОЕ/мл клинической суспензией грибковых изолятов Fusarium spp (фиг. 3). Инстилируется 2-3 капли 99% концентрата димексида. Выжидается 20-30 минут для испарения лишнего объема лекарственных средств. Промывание роговицы и конъюнктивальной полости 0,1% р-ром дексаметазона. Далее производится орошение конъюнктивальной поверхности 106 КОЕ/мл клинической суспензии грибковых изолятов Fusarium spp., включающей фрагменты мицелия. На внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы наносится 0,2-0,3 мл этой же суспензии. Мягкая контактная линза надевается на роговицу (фиг. 4). Повторно мероприятия проводились через 1 день в 5-6 приемов.

В результате вышеописанного алгоритма получен глубокий грибковый гипопион-кератоувеит с изъязвлением роговицы (фиг. 5), на 14-й день без лечения сформирована перфорация роговицы (фиг. 6), что является сопоставимым прогнозом развития грибкового кератита при отсутствии лечения в клинических случаях.

Применение спиртового раствора формалина позволяет полностью санировать конъюнктивальную полость экспериментальных животных, что подтверждено культуральными данными в начале исследования, получить химический ожог легкой степени и инициировать асептическое воспаление. Инстиляции дексаметазона позволяют достичь местной иммунносупрессии и предотвратить самостоятельную санацию условно-патогенного Fusarium spp. При электронной микроскопии соскобов с роговицы выявлено, что применение димексида способствует повышению адгезии грибковых элементов к эпителию, боуменовой оболочке и строме, что в результате улучшает результативность контаминации. Отсутствие мягкой контактной линзы приводит к самопроизвольной санации даже при выполнении вышеописанных условий. Интрастромальные инъекции позволили достичь картины агрессивного течения кератита, сопоставимого с клиническим.

Таким образом, заявленная методика позволяет воспроизвести глубокий грибковый кератоувеит с изъязвлением роговицы у кроликов с применением микроинвазивной травмы у экспериментальных животных, формалин обеспечивает предварительное обеззараживание конъюнктивальной полости, дополнительное применение дексаметазона подавляет защитные механизмы местного иммунитета, а димексид способствует повышению адгезии мицелии грибов в клинической суспензии.
Офтальмология
Александр
Самойлов
Николаевич
Заведующий кафедрой
Доктор медицинских наук
Профессор
-
-
РОССИЯ
Алексей
Созинов
Станиславович
Ректор
РОССИЯ
76.29.56
Офтальмология
03.02.SU
OPHTHALMOLOGY
Александр
Самойлов
Николаевич
Руководство, разработка способа, апробация
РОССИЯ
ФГБОУ ВО КАЗАНСКИЙ ГМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1021602848189
АЛЕКСЕЙ
СОЗИНОВ
СТАНИСЛАВОВИЧ
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения