Промотор pro-SmAMP-X из растения звездчатка белая (Stellaria media L.) для экспрессии рекомбинантных генов в клетках растений
транзиентная экспрессия Stellaria media промотор pro-SmAMP-X генетическая модификация экспрессия рекомбинантных генов
Изобретение относится к области биохимии, в частности к фрагменту ДНК для генетической модификации растительной клетки с целью экспрессии рекомбинантного гена в растении. Также раскрыты генетическая конструкция, содержащая указанный фрагмент ДНК, способ экспрессии рекомбинантного гена в растительной клетке, включающий использование генетической конструкции. Изобретение позволяет получать новые эффективные промоторы для повышенной экспрессии рекомбинантных генов. 3 н.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.


Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биологии, молекулярной биологии, биотехнологии и генетической инженерии растений, и может быть использовано в составе генетических конструкций для контроля экспрессии рекомбинантных генов и биосинтеза рекомбинантных белков в клетках растений. Настоящее изобретение может применяться для наработки рекомбинантных белков в клетках растений методом транзиентной экспрессии, для создания трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантные белки, для отбора трансгенных клеток, каллусов, побегов и проростков растений на питательной среде с селективным агентом. Настоящее изобретение может применяться в фундаментальных исследованиях биологии растений с использованием методов прямой и обратной генетики.

Уровень техники

Изучение промоторов необходимо для выяснения координированной экспрессии генов в клетках растений в изменяющихся условиях окружающей среды. В нуклеотидных последовательностях полноразмерных промоторов белок-кодирующих генов выделяют дистальную, проксимальную и «коровую» области. «Коровая» область содержит канонический цис-действующий элемент (или цис-элемент) TATA box, локализованный около 20-40 п.н. выше (или левее) сайта инициации транскрипции (Transcription Start Site, TSS), в котором базовые транскрипционные белки (RNA Pol II, TATA-binding proteins и TBP-associated factors) взаимодействуют для включения транскрипции (Hernandez-Garcia and Finer 2014). Изменение экспрессии генов достигается благодаря физическому взаимодействию между базовыми транскрипционными белками и регуляторными белками, связывающими примыкающую проксимальную промоторную область. Дистальная область промотора, наиболее удаленная от TSS, может влиять на эффективность экспрессии генов благодаря трехмерной подвижности ДНК и пространственному сближению с «коровой» областью.

Функциональную архитектуру полноразмерного промотора определяют множественные регуляторные элементы (энхансеры, сайленсоры, инсуляторы и цис-элементы) - специфические последовательности нуклеотидов для связывания регуляторными белками, распределенные вдоль нуклеотидной последовательности промотора. Взаимодействия между различными регуляторными последовательностями и связывающими их белками играют главную роль в определении эффективности и тканеспецифичности эукариотического промотора.

Изолированные нуклеотидные последовательности промоторов имеют существенное значение для регулирования экспрессии рекомбинантных генов в генетически-модифицированных клетках и растениях. Изолированные промоторы могут сохранять свои основные функции в гетерологичных растениях, однако качественные и количественные вариации экспрессии рекомбинантных генов под их контролем не являются редкостью и должны быть изучены для каждого промотора, который предлагается для биотехнологии растений (Hernandez-Garcia and Finer 2014).

Используемые в генетической инженерии растений промоторы классифицируют на конститутивные (активны в большинстве тканей и стадий развития), пространственно-временные (активны в определенных тканях и/или на определенных стадиях развития) и индуцибельные (активирующиеся при наличии внешних химических или физических воздействий). К отдельному классу относят синтетические промоторы, содержащие искусственный набор различных по происхождению регуляторных элементов (Hernandez-Garcia and Finer 2014).

Сильные и конститутивные промоторы наиболее востребованы в рутинной генетической инженерии растений, поскольку наряду с эффективной экспрессией «целевых» генов (генов интереса) способны обеспечивать экспрессию селективных генов на уровне, достаточном для отбора трансформированных клеток и побегов на средах с селективными агентами. Наиболее популярным сильным и конститутивным промотором для генетической инженерии растений является промотор CaMV35S, созданный на основе промоторной области 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV (Odell et al. 1985).

Ранее считали, что типичный промотор генов растений по размеру более 1 тыс. п.н. и значительно менее эффективен в сравнении сильными и конститутивными промоторами из вирусов растений (например, CaMV35S, MUASMSCP, FMV и др.), предложенными для биотехнологии растений (Odell et al. 1985; Ranjan et al. 2011; Acharya et al. 2014). Однако изолированные из патогенов растений промоторы могут приводить к нарушению развития трансгенных растений (Ali and Kim 2019), они менее предпочтительны с экологической точки зрения и их эффективность может подавляться в случае заражения генетически модифицированных растений вирусами (Al-Kaff et al. 2000).

Ранее в биотехнологии растений практически все трансгенные растения содержали два рекомбинантных гена, один из которых под контролем конститутивного промотора был необходим для селективного отбора трансформированных клеток, а другой «целевой» ген под контролем промотора любого типа был предназначен для изменения фенотипа растения. В настоящее время возможности мультигенной трансформации делают доступным импорт в растения целых метаболических путей, благодаря экспрессии нескольких «целевых» генов, и разработку трансгенных культур, одновременно производящих целый спектр соединений (Zhu et al. 2007; Peremarti et al. 2010). Но каждый дополнительный рекомбинантный ген нуждается в собственном промоторе, что требует применения в одной генетической конструкции различных промоторов со схожим уровнем и профилем экспрессии или одного промотора несколько раз. В первом случае ощущается дефицит доступных промоторов с необходимыми параметрами, а во втором случае введение повторяющихся последовательностей в один или разные локусы трансгенного растения может иметь негативное влияние на экспрессию и наследование входящих в них рекомбинантных генов из-за эффекта гомологозависимого замолкания (Mette et al. 1999; Lessard et al. 2002; Potenza et al. 2004; Mourrain et al. 2007).

Таким образом, несмотря на существующие достижения в области молекулярной биологии и биотехнологии, необходимость точной и координированной экспрессии рекомбинантных генов в трансгенных растениях обуславливает потребность поиска новых промоторов генов растений с разной генетической основой. Использование таких промоторов для экспрессии различных рекомбинантных генов позволит создавать стабильные трансгенные растения, эффективно продуцирующие ценные вторичные метаболиты или сложные белки.

Раскрытие сущности изобретения

Объектом изобретения является нуклеотидная последовательность промоторной области гена альфа-гарпинина SmAMP-X (GenBank: HG423454.1), ранее клонированного из генома растения звездчатка белая, или мокрица, (Stellaria media L.). Промотор pro-SmAMP-X представлен в качестве 5'-делеционных вариантов двух промоторных версий. Версия 1 промотора pro-SmAMP-X, обозначена как pro-SmAMP-X-1, представлена полноразмерной нуклеотидной последовательностью -1230 п.н. (SEC ID NO 1) и ее 5'-делеционными вариантами -381 п.н. (SEC ID NO 2), -248 п.н. (SEC ID NO 3) и -172 п.н. (SEC ID NO 4) относительно TSS гена альфа-гарпинина SmAMP-X. Версия 2 промотора pro-SmAMP-X, обозначена как pro-SmAMP-X-2, представлена двумя 5'-делеционными вариантами -405 п.н. (SEC ID NO 5) и -171 п.н. (SEC ID NO 6) относительно TSS гена альфа-гарпинина SmAMP-X. Промотор pro-SmAMP-X предназначен для создания генетических конструкций с целью экспрессии рекомбинантных генов в клетках растений и в трансгенных растениях, в том числе в их последовательных поколениях.

Генетические конструкции, с контролирующим экспрессию рекомбинантных («целевых» или селективных) генов промотором pro-SmAMP-X, и содержащие терминатор транскрипции, предназначены для генетической трансформации клеток растений, в том числе, с использованием штаммов агробактерий (Agrobacterium).

Штаммы агробактерий, содержащие генетические конструкции с «целевым» или селективным генами под контролем промотора pro-SmAMP-X, предназначены для агробактериальной инфильтрации тканей растений или для ко-культивации с растительными эксплантами с целью создания трансгенных растений.

Инфильтрация растительных тканей с использованием штаммов агробактерий, содержащих генетические конструкции с целевым геном под контролем промотора pro-SmAMP-X, обеспечивает биосинтез и накопление «целевого» белка на уровне, который сопоставим с уровнем накопления при использовании сильного вирусного промотора CaMV35S.

Агробактериальные штаммы, содержащие генетические конструкции с «целевым» геном под контролем промотора pro-SmAMP-X, после ко-культивации с растительными эксплантами позволяют создавать трансгенные растения, продуцирующие «целевые» рекомбинантные белки на уровне, сопоставимом с уровнем накопления при использовании сильного вирусного промотора CaMV35S.

Агробактериальные штаммы, содержащие генетические конструкции с селективным геном под контролем промотора pro-SmAMP-X, после ко-культивации с растительными эксплантами позволяют отбирать трансгенные клетки, каллусы, побеги и проростки растений на питательной среде с селективным агентом в избыточной концентрации. Это свойство промотора обеспечивает более строгую и эффективную селекцию трансгенных клеток.

Основной технический результат изобретения заключается в расширении арсенала новых эффективных промоторов для генетической инженерии растений, в том числе для экспрессии рекомбинантных генов с различной эффективностью.
Промотор pro-SmAMP-Х может быть рекомендован для биотехнологии растений в качестве регуляторного элемента с целью контроля экспрессии рекомбинантных («целевых» и селективных) генов. Этот промотор подходит как для транзиентной экспрессии, так и для создания трансгенных растений, его эффективность сохраняется в ряду последовательных поколений. Промотор может быть использован для генетической модификации растений из разных ботанических семейств, в том числе для генетической инженерии сельскохозяйственных культур. Использование делеционных вариантов pro-SmAMP-Х, обладающих разной эффективностью, позволит скоординировать экспрессию рекомбинатных генов под его контролем с экспрессией рекомбинантных или нативных генов под контролем других промоторов. Дополнительным преимуществом является то обстоятельство, что промотор pro-SmAMP-Х имеет отличающуюся от известных промоторов генетическую основу, поэтому может быть использован для модификации растений, находясь в составе одной генетической конструкции с другими промоторами из мокрицы. Сравнение между собой свойств 1 и 2 версий промотора pro-SmAMP-Х, свидетельствует, что наблюдаемый между ними полиморфизм функционален и может быть использован для понимания фундаментальных механизмов работы растительных промоторов и для «тонкого» тюнинга промоторов.
Роман
Комахин
Александрович
Ведущий научный сотрудник
Кандидат биологических наук
Отсутствует
-
8382570700
133662
РОССИЯ
Геннадий
Карлов
Ильич
Директор
РОССИЯ
34.23.57
Генетика и селекция растений
01.06.KM
GENETICS & HEREDITY
Роман
Комахин
Александрович
Руководитель
РОССИЯ
Любовь
Иванова
Александровна
Исполнитель
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБНУ ВНИИСБ
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной   биотехнологии»
1037739342123
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения