Способ создания клеточных моделей транслокаций с помощью инструментов редактирования генома
транслокация редактирование генома клеточная модель лейкоз CRISPR/Cas
Основная сложность в получении клеточных линий с транслокацией заключается в том, что транслокация возникает только при ошибочной репарации разрывов, когда вместе сшиваются концы, принадлежащие разным разрывам, что происходит очень редко. Поэтому способ получения линий направлен на выявление тех единичных клеток в популяции, в которых произошла транслокация, и их отбор. Первичный отбор осуществляют по флуоресценции репортерного белка, и гарантия того, что все необходимые для индукции транслокации элементы (гены Cas9 и РНК-гидов) попали в клетку обеспечивается тем, что все эти элементы вместе с геном флуоресцентного белка собраны в одну плазмиду. Такая плазмида для индукции новой транслокации создается на основе универсального вектора в два шага клонирования. Для выявления транслокации используют ПЦР, причем без отдельной стадии выделения ДНК (т.н. прямая ПЦР), комбинируя этот подход с вложенной ПЦР, повышающей чувствительность метода. Для надежного получения клеточной линии с транслокацией с вероятностью не менее 0,95, может проводиться предварительная проверка эффективности РНК-гидов и подсчет частоты транслокаций. Основываясь на частоте транслокаций, подбирают оптимальную стратегию клонирования на субпопуляции и стратегию ПЦР-анализа с объединением нескольких образцов в одну реакцию. Клонирование проводят с помощью клеточного сортера. Полученные моноклональные линии характеризуют на предмет наличия транслокации, секвенируют область перестройки, показывают экспрессию продукта слитого гена и могут далее использовать для заявляемых целей. Заявляемый метод позволяет получить моноклональные линии с транслокациями в кратчайший срок и с минимальными затратами времени и ресурсов лаборатории. В наибольшей степени эти преимущества способа проявляются при получении сразу нескольких клеточных моделей разных транслокаций.
Создание клеточных линий с транслокациями позволяет получить удобную модель лейкозов для их изучения на клеточном уровне. Так, можно проводить исследование дифференциальной экспрессии генов на полученных клетках в сравнении с клетками без транслокации или же сравнивать между собой исходно однородные клетки с разными транслокациями. Результаты таких исследований позволят лучше понять особенности лейкозных клеток и выявить потенциальные мишени для терапии. На полученных клетках возможно тестировать различные химиотерапевтические агенты.
34.15.05
Методы и аппаратура в молекулярной биологии
34.15.23
Молекулярная генетика
Михаил
Рубцов
Александрович
"Кандидат биологических наук"
"Отсутствует"
"A-8435-2014"
"24177126300"
РОССИЯ
Владимир
Вьюшков
Сергеевич
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"0"
"57203979183"
"0"
"0"
РОССИЯ
Николай
Ломов
Андреевич
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"O-6041-2017"
"57194523424"
"-"
"https://istina.msu.ru/profile/lomov13/"
"0000-0003-2101-3479"
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Петр
Мордовской
Григорьевич
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА, МГУ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА, МОСКОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИЛИ МГУ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА"
1037700258694
ВИКТОР
САДОВНИЧИЙ
АНТОНОВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения