Способ количественной оценки Т и В-лимфоцитов по содержанию эксцизионных колец TREC и KREC в образцах ДНК с помощью цифровой полимеразной цепной реакции
лимфоциты Т-лимфоциты В-лимфоциты цифровая ПЦР
Изобретение относится к области молекулярной и клеточной биологии и предназначено для оценки количества Т и В-лимфоцитов в исследуемых образцах ДНК человека с помощью цифровой капельной полимеразной реакции, основанной на методике абсолютной квантификации молекул ДНК, содержащих сигнальные фрагменты эксцизионных колец Т и В-лимфоцитов. 
Иммунную систему можно условно разделить на две основные компоненты: врожденная иммунная система, которая обеспечивает немедленную, но неспецифическую защиту от чужеродных веществ, и адаптивная иммунная система, которая обеспечивает специфическую защиту от патогенов и обладает способностью запоминать предыдущие встречи с тем же возбудителем. Основными представителями адаптивной иммунной системы являются Т и В-лимфоциты (1, 2), которые распознают специфические антигенные пептиды при содействии главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) (3, 4). 
Распознавание специфических антигенных пептидов обеспечивается Т и В клеточными рецепторами, TCR и BCR, соответственно, находящимися на поверхности клетки. У Т-лимфоцитов TCR состоит из альфа- и бета-цепей (2). У В-лимфоцитов рецептор состоит из тяжелых и легких цепей иммуноглобулина. Объединяющим фактором лимфоцитов является их разнообразие по репертуарам за счет гипервариабельных областей их клеточных рецепторов. 
Внутри цепи TCRβ определяющая комплементарность область 1 (CDR) 1 и CDR2 контактируют с альфа-спиралями ГКГС, в то время как гипервариабельные области CDR3 взаимодействуют в основном с антигенным пептидом (1, 2). CDR3 в альфа- и бета-цепях TCR имеют широкий диапазон разнообразных последовательней, обеспечивающих обнаружение антигенного пептида. Схожим механизмом распознавания обладают и иммуноглобулины, вырабатываемые В-лимфоцитами.
Несмотря на гипервариабельность локуса, обеспечивающего распознавание антигенного пептида, каждый лимфоцит обладает уникальной и неизменной последовательностью данного локуса. Подобная стабильность локуса обеспечивается за счёт механизмов перманентной перестройки собственного генома клетки.
В процессе рекомбинации TCR вырезанные фрагменты ДНК создают круги эксцизии Т-клеточных рецепторов (TREC), которые экспортируются в цитоплазму Т-клеток (5, 6). В частности, сигнальный совместный TREC δRec-ψJα (sjTREC) продуцируется во время делеции TCRD и обнаруживается примерно в 70% (альфа-бета) αβ Т-клеток. Они считаются наиболее оптимальной мишенью для оценки их продукции тимусом (7–9). Кольца вырезания рекомбинации с удалением каппа (KREC) образуются во время перестройки BCR в наивных В-клетках и аналогичны TREC (10). Сходным образом, sjKREC, образующийся во время реаранжировок intronRSS-Kde в локусе IGK, является надежной мишенью для оценки неогенеза В-клеток из костного мозга (11,12).
Как TREC, так и KREC стабильны и нерепликативны во время пролиферации клеток (13, 14). Анализ TREC и KREC широко применяется в различных клинических условиях для оценки продукции T и B-клеток тимусом и костным мозгом. Измерение уровней TREC и KREC в периферической крови используется для скрининга и мониторинга иммунодефицитных заболеваний.
Существует ряд изобретений близких по заявляемой технической сущности (15-18). Кроме того, известны методы оценки количества TREC и KREC для диагностики первичных и вторичных иммунодефицитов у человека (19). Тем не менее, основной отличительной их особенностью является использование технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, а также использования других разработанных наборов праймеров. 
В данной работе, авторы предлагают способ с использованием цифровой ПЦР, а не ПЦР в режиме реального времени, что в значительной степени повышает точность измерения. Технология цифровой ПЦР (digital PCR, dPCR или digital droplet PCR, ddPCR) имеет преимущество в отношении меньшей чувствительности  к ингибиторам ПЦР. Кроме того, она позволяет получить точные (абсолютные) измерения количества копий участков ДНК, путём проведения флуоресцентных анализов, протекающих в десятках тысяч независимых реакций (капель, лунок) (20, 21). Точность измерения повышается за счет измерения каждой введенной молекулы ДНК, содержащих целевой фрагмент, т.е. абсолютная квантификация ДНК. Подобная точность достигается за счет разобщения каждой молекулы ДНК на 20 тыс. независимых реакций. 
Отличительной особенностью цифровой ПЦР от количественной ПЦР в режиме реального времени является измерение флуоресценции не во время ПЦР, а «по конечной точке», т.е. по завершению ПЦР. Тем самым достигается высокая точность анализа, который позволяет определить целочисленное количество копий в локусах, по сравнению с другими технологиями (20-22). 
Новая техническая задача – подбор последовательностей (структуры) олигонуклеотидных проб, разработка протокола проведения цифровой ПЦР для абсолютной квантификации (точного определения количества) сигнальных фрагментов эксцизионных колец Т и В-клеточных рецепторов, содержащихся в биологическом образце человека.
Указанный результат достигается за счет разработки набора синтетических олигонуклеотидных последовательностей и проб, а также протокола проведения цифровой ПЦР для подсчета количества Т и В-лимфоцитов в биологическом образце человека.
Техническим результатом изобретения является повышение точности оценки количества Т и В-лимфоцитов в интересующих биологических образцах человека, по сравнению с существующими аналогами.
Возможно использовать для медицинский целей по анализу иммунного состояния пациентов
34.15.23
Молекулярная генетика
34.43.41
Иммунодефицитные состояния
34.43.45
Онкоиммунология
Алексей
Слепцов
Анатольевич
"Кандидат медицинских наук"
"Отсутствует"
"A-8163-2014"
"57204324664"
"638022"
"https://www.tnimc.ru/kontakty/personalii/nii-meditsinskoy-genetiki/sleptsov-aleksey-anatolevich/"
"0000-0003-3226-1750"
РОССИЯ
Анна
Гусельникова
Викторовна
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"-"
"-"
"-"
""
"-"
РОССИЯ
Наиль
Валиахметов
Раушанович
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"B-3147-2019"
"57204462145"
"1015784"
"https://www.tnimc.ru/kontakty/personalii/nii-meditsinskoy-genetiki/valiakhmetov-nail-raushanovich-/"
"0000-0001-7969-7020"
РОССИЯ
Людмила
Назаренко
Павловна
"Доктор медицинских наук"
"Профессор"
"A-9466-2014"
"57050653900"
"93905"
"https://www.tnimc.ru/kontakty/personalii/nii-meditsinskoy-genetiki/nazarenko-lyudmila-pavlovna/"
"0000-0002-1861-433X"
РОССИЯ
Мария
Назаренко
Сергеевна
"Доктор медицинских наук"
"Отсутствует"
"A-7917-2014"
"13805424900"
"138159"
"http://www.medgenetics.ru/persona/201542/"
"0000-0002-0673-4094"
РОССИЯ
Дмитрий
Орлов
Сергеевич
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"B-9329-2017"
"56478510500"
"863191"
"https://www.tnimc.ru/kontakty/personalii/nii-meditsinskoy-genetiki/orlov-dmitriy-sergeevich/"
"0000-0001-7525-0176"
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Петр
Мордовской
Григорьевич
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ТОМСКИЙ НИМЦ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ТОМСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК"
1027000861568
ВАДИМ
СТЕПАНОВ
АНАТОЛЬЕВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения