Патент на изобретение "Способ выявления видов возбудителей дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis с помощью ПЦР в режиме реального времени" №2773944
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЬ ДИРОФИЛЯРИОЗА DIROFILARIA REPENS ВОЗБУДИТЕЛЬ ДИРОФИЛЯРИОЗА DIROFILARIA IMMITIS ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ПАРАЗИТОЛОГИЯ
Изобретение относится к области медицинской паразитологии, ветеринарии, а именно молекулярной диагностики, и может быль использовано при молекулярно-генетической диагностике возбудителей дирофиляриоза, а также для межвидовой дифференциации видов Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в достоверном выявлении видов возбудителей дирофиляриоза D. repens и D. immitis с помощью ПЦР в режиме реального времени с помощью предлагаемых праймеров, специфичных для каждого вида дирофилярий, и состоящих из двух пар видовых праймеров: 
для Dirofilaria repens 
(F2690DR)     5’-АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’ 
(R2812DR)     5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’ 
для Dirofilaria immitis
(F2690DI)    5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’
(R2812DI)    5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’
выявление осуществляют автоматически в ходе проведения ПЦР на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации специфичных для D. repens и D. immitis со специфическими праймерами; в случае наличия в пробе ДНК D. repens, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DR/R2812DR, а в случае наличия в пробе ДНК D. immitis, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DI/R2812DI.
Поставленная задача предусматривает предварительную подготовку исследуемой ДНК, которая включает: промывку нативных гельминтов однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживание при температуре -20±2 ᵒС; затем механическое перетирание и гомогенизация до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия)   для постановки ПЦР. 
Кроме того, ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 
10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen– 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер видовой F (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер видовой R (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл.
При этом ПЦР проводят с соблюдением режимов:
- денатурация при 95 ᵒС -5 мин (1 цикл);
- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95 ᵒС - 10 с., отжиг при 60 ᵒС - 10 с., синтез при 72 ᵒС - 30 с.;
- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90 ᵒС - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5 ᵒС/10 с.;
- хранение при 10 ᵒС.
Изобретение относится к области медицинской паразитологии, ветеринарии, а именно молекулярной диагностики, и может быль использовано при молекулярно-генетической диагностике возбудителей дирофиляриоза, а также для межвидовой дифференциации видов Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis.
Сергей
Нагорный
Андреевич
Ведущий научный сотрудник
Кандидат биологических наук
Отсутствует
-
56126478300
92565
0000-0001-8487-2313
РОССИЯ
Татьяна
Твердохлебова
Ивановна
Директор
РОССИЯ
76.33.43
Эпидемиология
76.03.45
Медицинская паразитология
03.03.TI
PARASITOLOGY
Виктория
Агафонова
Владиславовна
10%
РОССИЯ
Лариса
Ермакова
Александровна
10%
РОССИЯ
Игорь
Корниенко
Валериевич
16%
РОССИЯ
Юлия
Киосова
Владимировна
16%
РОССИЯ
Мария
Калюжина
Александровна
16%
РОССИЯ
Сергей
Нагорный
Андреевич
16%
РОССИЯ
Виктория
Теличева
Олеговна
16%
РОССИЯ
Роспотребнадзор
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
1047796261512
Организация
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Федеральные государственные казенные учреждения
ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии
Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии"
1026144023157
Организация
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Федеральные государственные бюджетные учреждения