Способ определения активности ферментов эксцизионной репарации оснований ДНК в клетках человека
Эксцизионная репарация эндонуклеазы рестрикции клеточные экстракты ДНК-зонд
Запускают реакцию путем смешивания растворов ДНК-зонда и клеточного экстракта в соотношении 1:1 и регистрируют изменение интенсивности флуоресценции FRET-пары в интервале времени 15-3600 сек. Для этого, в 96-луночном планшете для флуориметра смешивают растворы субстрата (1,0×10-6 М), буфера (50 мМ Tris-HCl pH 7.5, 50 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 7% глицерин) и образца экстракта клеточных линий рака яичника. В качестве ДНК-зондов используют самокомплементарные олигодезоксирибонуклеотиды, несущие FRET-пару FAM/BHQ1 на концах цепи, а также содержащие в своем составе повреждение, специфичное для определенного фермента. Структура и специфичность использованных ДНК-зондов представлена в таблице 1. Для предотвращения неспецифической 3′-5′-экзонуклеазной деградации ДНК-зонда в клеточном экстракте 3′-концевая межнуклеотидная фосфатная группа заменена на тиофосфатную (ps). Изменение интенсивности флуоресценции субстрата в реакционной смеси регистрируют в спектральном диапазоне 500-550 нм, возбуждение флуоресценции проводят на длине волны 494 нм. Начальный участок кинетических кривых обрабатывают методом линейной аппроксимации. Использование способа позволяет повысить точность и достоверность определения активности ферментов BER, и, наряду с этим, ускорить и упростить проведение анализа.
Научные исследования
Александра
Кузнецова
Александровна
Зав.лабораторией
Кандидат химических наук
Отсутствует
G-5119-2013
36906942600
150160
0000-0002-9805-7050
РОССИЯ
Владимир
Коваль
Васильевич
Исполняющий обязанности директора
РОССИЯ
34.15.27
Генетическая инженерия
01.06.CQ
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
Александра
Кузнецова
Александровна
РОССИЯ
Никита
Кузнецов
Александрович
РОССИЯ
Ирина
Алексеева
Владимировна
РОССИЯ
Ольга
Кладова
Алексеевна
РОССИЯ
Ольга
Федорова
Семеновна
РОССИЯ
РНФ
Российский научный фонд
1137799022261
Организация
Организации, учрежденные юридическими лицами или гражданами, или юридическими лицами и гражданами совместно
Фонды
ИХБФМ СО РАН
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
1025403659852
ДМИТРИЙ
ПЫШНЫЙ
ВЛАДИМИРОВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения