Способ определения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы
лейкоцитарные маркеры химиотерапия рак молочной железы циркулирующие опухолевые клетки
Определяют экспрессию на ядросодержащих клетках общего лейкоцитарного маркера CD45, эпителиальных маркеров CD326 (ЕрСАМ) и пан-цитокератина АЕ1/АЕ3 и маркера эритроцитов CD235a (гликофорина А), для этого образец ЭДТА-стабилизированной венозной крови в объеме 9 мл забирают утром натощак, первый мл крови в исследование не берут, далее проводят обогащение популяции циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) с помощью метода негативной селекции, к образцу крови добавляют полистироловые частицы с сорбированными антителами к CD45, CD66b и CD235a (гликофорин А) в концентрации 50 мкл на 1 мл крови и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, затем образец разводят 1:1 фосфатно-солевым буфером, наносят на градиент плотности с р равным 1.077 при соотношении 1 часть градиента и 2 части разбавленного образца, далее образцы центрифугируют при 1200g в течение 20 минут, затем удаляют 2/3 верхней фракции и собирают содержимое кольца на границе раздела фаз градиент-плазма, далее полученную клеточную суспензию отмывают в 3 мл фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% фетальной бычьей сыворотки, центрифугированием при 300g в течение 10 минут и дважды при 110g по 10 минут, супернатант удаляют, к клеточному осадку добавляют 150 мкл буфера, далее образец делят на две части: неокрашенную контрольную пробу в объеме 50 мкл и окрашенную пробу в объеме 100 мкл, в обе пробы добавляют по 25 мкл фиксирующего буфера PerFix-nc Buffer 1, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 15 минут при 18-25°С, затем добавляют 300 мкл пермеабилизирующего буфера PerFix-nc Buffer 2, перемешивают на вортексе, в пробы немедленно добавляют антитела анти-CD45-АРС-Су7 (клон HI30, мышиные IgG1), анти-CD326(EpCAM)-AF488 (клон 9С4, мышиные IgG2b), анти-пан-цитокератин-АР647 (клон АЕ1/АЕ3, мышиные IgG1) и анти-CD235а(гликофорин А)-РегСР-Су5.5 (клон HI264, мышиные IgG2a) из расчета 5 мкл антител на 106 клеток, инкубируют в темноте в течение 20-30 минут при 18-25°С, далее к образцам добавляют по 3 мл буфера PerFix-nc Buffer 3 и центрифугируют при 300g в течение 6 минут, супернатант удаляют, затем к пробам добавляют по 100 мкл буфера, после чего весь полученный объем образца анализируют на проточном цитометре, одновременно детектируют сигналы флуоресцентных меток: AF488, РегСР-Су5.5, AF647, АРС-Су7 и рассчитывают концентрацию циркулирующих опухолевых клеток на 1 мл цельной крови по следующей формуле.
Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии для определения циркулирующих опухолевых клеток у больных с целью определения чувствительности циркулирующих опухолевых клеток к химиотерапии и прогнозирования вероятности возникновения гематогенных метастазов при раке молочной железы. Применение изобретения обеспечивает повышение информативности и чувствительности способа.
Надежда
Чердынцева
Викторовна
заместитель директора по научной работе
Доктор биологических наук
Член-корреспондент РАН
C-7943-2012
6603911744
81344
https://www.tnimc.ru/kontakty/personalii/nii-onkologii/cherdyntseva-nadezhda-viktorovna/
0000-0003-1526-9013
РОССИЯ
Вадим
Степанов
Анатольевич
Директор
РОССИЯ
76.29.49
Онкология
03.02.DM
ONCOLOGY
Сергей
Вторушин
Владимирович
консультирование
РОССИЯ
Евгений
Денисов
Владимирович
консультирование
РОССИЯ
Надежда
Чердынцева
Викторовна
общее руководство
РОССИЯ
Ольга
Савельева
Евгеньевна
подбор и расположение материала
РОССИЯ
Любовь
Таширева
Александровна
набор клинического материала
РОССИЯ
Евгения
Григорьева
Сергеевна
набор материала
РОССИЯ
Наталья
Тарабановская
Анатольевна
набор клинического материала
РОССИЯ
Владимир
Перельмутер
Михайлович
консультирование
РОССИЯ
Владимир
Алифанов
Валерьевич
набор клинического материала
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ТОМСКИЙ НИМЦ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ТОМСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК"
1027000861568
ВАДИМ
СТЕПАНОВ
АНАТОЛЬЕВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения