2-Амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид и 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-(фениламино) бензамидо)-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид, ингибирующие процесс полимеризации тубулина, обладающие цитотоксической и противоопухолевыми активностями в отношении эпителиальных опухолей человека
цитостатическое средство цитотоксическое и противоопухолевое средство
Изобретение относится к применению производных пиррола: 2-амино-1-бензамидо-5-(2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (I) и 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-(2-фениламино)-бензамидо)-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамида (II), в качестве цитотоксического и противоопухолевого средства. Соединения I и II эффективно ингибируют полимеризацию тубулина и являются тубулин-деполимеризующими агентами, способствуют селективному накоплению клеток в G2/M-фазах клеточного цикла, имеют высокую аффинность к колхициновому сайту, индуцируют повышение уровня экспрессии расщепленных форм каспазы-3, поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы и фосфогистона 2AX, а также подавляют рост опухолей. Токсичность соединений I и II меньше, чем у паклитаксела. Технический результат – эффективная цитотоксическая и противоопухолевая активность. 2 н.п. ф-лы, 7 ил.
Изобретение относится к области органической химии, производным пиррола, а именно, новым биологически активным - 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамиду I формулы:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)-бензамидо]-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамиду II формулы:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

которые могут найти применение в качестве цитостатического средства в медицине.

Синтез заявленных соединений I и II осуществляется рециклизацией гидразонов 2,3-фурандионов III, IV под действием цианоацетамида в абсолютном толуоле или диоксане в присутствии основного катализатора триэтиламина по схеме [1]:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Методика получения 2-амино-1-бензамидо-5-(2-нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (I). Смесь .0.86 г (0.0025 моль) N-[5-(нафталин-2-ил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден]бензогидразида (III), 0.21 г (0.0025 моль) цианоацетамида и 0.25 г (0.0025 моль) триэтиламина кипятили в 60 мл абсолютного диоксана в течение 30 минут. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из этанола. Получали 0.60 г (56%) бесцветного кристаллического вещества (I) с Тпл 281-282°С. C24H18N4O4. ИК-спектр, ν/см-1, вазелиновое масло: 3482 (NH), 3181 (NH), 1666 (С=О), 1615 (C=C); Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-d6), δ, м.д.: 6.85 с (1Н, СН), 7.59 м (13Н, Наром), 8.41 с (1Н, NH), 8.67 с (1Н, NH), 9.11 уш. с (1Н, NH), 10.91 с (1Н, NH). Спектр ЯМР 13С, δ, м.д., ДМСО-d6: 66.85, 88.24, 103.98, 123.77, 127.40, 128.07, 128.22, 129.26, 130.23, 131.39, 131.59, 132.43, 132.53, 135.02, 135.61, 142.19, 165.84, 166.18, 167.34, 176.43, 190.64

Масс-спектр, m/z (Iотн, %): 426 [M]+ (24.0), 349 [M – С6Н5 ]+ (12.0), 271 [M - нафталин-2-илСО]+ (18.0), 155 [нафталин-2-илСО]+ (49.0), 105 [С6Н5СО]+ (100.0), 77 [С6Н5]+ (23.0).

Методика получения 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)бензамидо]-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (II) . Смесь .0.68 г (0.0025 моль) N-[5-трет-бутил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден]-2-(фениламино)бензогидразида (IV), 0.21 г (0.0025 моль) цианоацетамида и 0.25 г (0.0025 моль) триэтиламина кипятили в 60 мл абсолютного толуола в течение 20 минут. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из этанола. Получали 0.75 г (67%) желтого кристаллического вещества (II) с Тпл 265-267°С. C24H25N5O4 ИК спектр, ν, см-1: 3450, 3310, 1685, 1647, 1598. Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-d6), δ, м.д.: 1.14 с (9Н, 3 Me), 6.39 с (1Н, СН), 6.46 с (1Н, СН), 7.37 м (9Н, Наром.), 7.11 с (1Н, NH), 7.13 с (1Н, NH), 7.77 с (1Н, NH), 7.79 с (1Н, NH), 7.92 с (1Н, NH), 7.94 с (1Н, NH). m/z (I, %): 447 (100.0) [M]+, 196 (74.0) [2PhNHPhCO)]+, 168 (5.5) [2PhNHPh)]+.

Спектральные данные и физико-химические свойства аминопиррола II полностью совпадают с данными ранее полученного соединения [1].

Ближайшим структурным аналогом к заявленному соединению являются соединения - этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1Н-пирролидин-3-карбоновых кислот общей формулы V, проявляющие противоопухолевую активность [2].

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

В качестве эталона сравнения нами взят противоопухолевый препарат - паклитаксел [3], ЛД 50 которого составляет 48 мг/кг.

В тесте острой токсичности ЛД 50 оба заявляемых соединения имеют токсичность более 1000 мг/кг. 2-Амино-1-бензамидо-5-(2-(нафталин-2-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамид I имеет ЛД 50 равную 1640 мг/кг, а 2-амино-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-1-[2-(фениламино)-бензамидо]-4,5-дигидро-1H-пиррол-карбоксамид II имеет ЛД 50, равную 1820 мг/кг.

Таким образом, токсичность соединений I и II гораздо меньше, чем у прототипа биологической активности - паклитаксела.

Было отмечено, что при инкубации эпителиальных опухолевых клеточных линий (HCC1806 и MDA-MD-231 - рак молочной железы, Н1299 немелкоклеточный рак легкого, PC-3 рак предстательной железы) с соединениями I и II в течение 12 часов, клетки приобретают округлую форму схожую с результатом их инкубирования с паклитакселом. На фиг.1 отражены результаты световой микроскопии опухолевых клеток рака молочной железы линии HCC1806: цифра 1 отражает контрольные клетки; цифры 2 и 3 - клетки, которые подвергались воздействию прототипов биологической активности (паклитаксела и винбластина, соответственно); цифры 4 и 5 - клетки, инкубированные с соединениями I и II, соответственно.

В связи с этим, было предпринято изучение воздействия соединений на процесс полимеризации тубулина, показавшее, что соединения I и II эффективно ингибируют полимеризацию тубулина и являются тубулин-деполимеризующими агентами. На фиг.2 отражено влияние соединений I и II, а также паклитаксела и винбластина на процесс полимеризации тубулина. (CaCl2 -отрицательный контроль).

Данный факт был подтвержден результатами иммунофлюоресцентного окрашивания опухолевых клеток линии HCC1806, культивированных в присутствии данных соединений, а также химиопрепаратов, усиливающих (паклитаксел) и ингибирующих (винбластин) сборку микротрубочек. Паттерн окрашивания тубулина в клетках, культивированных с соединениями I и II, был аналогичен таковому в клетках, культивированных с винбластином, что доказывало, что соединения I и II эффективно нарушают работу сети микротрубочек тубулина. На фиг.3 показан характер окрашивание белка альфа-тубулина в опухолевых клетках линии HCC1806, инкубированных с соединениями I и II, а также химиопрепаратами паклитакселом и винбластином.

Принимая во внимание важную роль белка тубулина в регуляции клеточного цикла и прохождении его М-фазы, с помощью метода проточной цитометрии было предпринято исследование по изучению распределения фаз клеточного цикла в опухолевых клетках рака молочной железы, культивированных с данными соединениями и химиопрепаратами (винбластин и паклитаксел). Было показано селективное накопление клеток в G2/M-фазах клеточного цикла. На фиг.4 показано распределение фаз клеточного цикла в опухолевых клетках линии HCC1806, инкубированных с соединениями I и II, а также химиопрепаратами паклитакселом и винбластином.

Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на предмет экспрессии гистона 3, фосфорилированного по остатку Ser10 (pH3Ser10), являющегося маркером клеток, находящихся в состоянии митоза, подтвердили селективное накопление клеток в М-фазе. На фиг.5 показано, как соединения I и II вызывают дозо-зависимое накопление опухолевых клеток HCC1806, экспрессирующих гистон 3, фосфорилированный по остаткам серина в положении 10 (маркер М-фазы клеточного цикла). Учитывая способность известных химиопрепаратов, влияющих на процесс деполимеризации тубулина, связываться в данным белком через специфические сайты, был проведен молекулярный докинг, показавший высокую аффинность данных соединений к колхициновому сайту.

Определение цитотоксической активности соединений I и II проводилось in vitro посредством вестерн-блоттинга. Было обнаружено, что данные соединения индуцируют повышение уровне экспрессии расщепленных форм каспазы-3 и поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы, используемых как маркеры апоптоза в опухолевых клеточных линиях рака молочной железы НСС1806 (Фиг. 6А), MDA-MB-231 (Фиг. 6Б), немелкоклеточного рака легкого Н1299 (Фиг. 6В) и предстательной железы (Фиг. 6Г), обработанных соединениями I и II. Аналогичная закономерность была выявлена в отношении уровня экспрессии фосфорилированной формы гистона H2AX, что указывало на несостоятельность процессов репарации ДНК в опухолевых клетках, инкубированных с данными соединениями.

В завершение, противоопухолевая активность соединений I и II была оценена на ксенографтных опухолях молочной железы с использованием клеточной линии HCC1806. Модели ксенографтных опухолей были ранее успешно использованы нами как при оценке противоопухолевой активности синтезированных соединений [4], так и некоторых таргетных препаратов, в частности, ингибиторов FGFR-сигнального пути [5]. При введении лабораторным животным соединений I и II была обнаружена их способность подавлять скорость роста ксенографтных опухолей и приводить к значительному уменьшению их размера (по сравнению с размерами опухолей до начала введения животным данных соединений). Важно отметить, что противоопухолевый эффект соединений был более выраженным по сравнению с паклитакселом, несмотря на то, что концентрация химиопрепарата была в 5 раз выше по сравнению с использованными соединениями. На Фиг.7 показано как соединения I и II (2 мг/кг), а также паклитаксел (10 мг/кг), (положительный контроль) ингибируют рост ксенографтных опухолей НСС1806.

Таким образом, соединения I и II обладают как выраженной цитотоксической, так и противоопухолевой активностью в сравнении с прототипами - эталонами сравнения паклитакселом и винбластином.

Список литературы

1. Кизимова И.А., Игидов Н.М., Киселев М.А., Дмитриев М.В., Чащина С.В., Сюткина А.И. Синтез новых производных 2-аминопирролов реакцией 3-ацилгидразонов 2,3-фурандионов с CH-нуклеофилами // Журнал общей химии. - 2020. - Т. 90. - №. 2. - С. 192-198.

2. Патент № 2607920 Российская Федерация, МПК C07D417/00, А61К31/195. Этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1Н-пирролидин-3-карбоновых кислот, проявляющие противоопухолевую активность, и способ их получения: № 2015120527: заявл. 29.05.2015: опубл. 11.01.2017 / С.С. Зыкова, Н.М. Игидов, М.В. Киселев, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова.

3. Патент № 2059631, МПК C07D305/14, A61K31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: № 91 5010248 : заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентино Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью.

4. Boichuk S., Galembikova A, Dunaev P, Micheeva E., Novikova M., Khromova N, Kopnin P. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates (EAPCs) are active against imatinib (IM)-resistant gastrointestinal stromal tumors (GIST) in vitro and in vivo. Anti-Cancer Drugs. 2019 Jun;30(5):475-484.

5. Boichuk, S.; Galembikova, A.; Mikheeva, E.; Bikinieva, F.; Aukhadieva, A.; Dunaev, P.; Khalikov, D.; Petrov, S.; Kurtasanov, R.; Valeeva, E.; Kireev, I.; Dugina, V.; Lushnikova, A.; Novikova, M.; Kopnin, P. Inhibition of FGF2-Mediated Signaling in GIST-Promising Approach for Overcoming Resistance to Imatinib. Cancers 2020, 12, 1674. doi: 10.3390/cancers12061674.
органическая химия
Сергей
Бойчук
Васильевич
Заведующий кафедрой
Доктор медицинских наук
Профессор
-
-
РОССИЯ
Алексей
Созинов
Станиславович
Ректор
РОССИЯ
31.21.17
Реакционная способность
01.04.EE
CHEMISTRY, ORGANIC
Сергей
Бойчук
Васильевич
РОССИЯ
Айгуль
Галембикова
Рафиковна
РОССИЯ
ФГБОУ ВО КАЗАНСКИЙ ГМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1021602848189
АЛЕКСЕЙ
СОЗИНОВ
СТАНИСЛАВОВИЧ
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения