Патент на изобретение № 2802300 "ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ АГЕНТЫ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ СОБОЙ 3,7-ДИЗАМЕЩЕННЫЕ [1,2,4]ТРИАЗОЛО[1,5-b][1,2,4,5]ТЕТРАЗИНЫ"
Фармацевтическая химия 3,7-дизамещенных производных [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина Противотуберкулезные агенты
(54) ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ АГЕНТЫ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ СОБОЙ 3,7-ДИЗАМЕЩЕННЫЕ [1,2,4]ТРИАЗОЛО[1,5-b][1,2,4,5]ТЕТРАЗИНЫ

(57) Реферат:

Группа изобретений относится к фармацевтической химии и включает 3,7-дизамещенные [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразины формулы I-VI и способ их получения. Где R = 2-пиридил, R1 = 3,5-диметилпиразол-1-ил (I); R = пиразол, R1 = метокси (II); R = 1,2,4-триазол-1-ил, R1 = метокси (III); R = 1,2,4-триазол-1-ил, R1 = этокси (IV); R = 3-нитрофенил, R1 = изопропокси (V); R = метил, R1 = ONa (VI). Технический результат - 3,7-дизамещенные [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразины формулы I-VI, обладающие антибактериальной активностью. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)


Изобретение относится к фармацевтической химии и касается новых 3,7-дизамещенных производных [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, содержащих в 3 положении азолотетразиновой системы 3,5-(диметипиразол-1-ил)-, или метокси, или этокси, или изопропокси заместители, а также солевую форму гидроксигруппы (NaO-), а в положении 7 - метил, или пиразол-1-ил, или -пиридил, или [1,2,4]триазол-1-ил, или 3-нитрофенил. Заявляемые вещества расширяют арсенал биологически активных соединений, обладающих антибактериальной активностью, и могут быть использованы в качестве противотуберкулезных агентов для лечения больных туберкулезом. Раскрываемые в настоящем изобретении соединения представляют собой вещества общей формулы:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Соединения I-VI новые, антибактериальная активность для данных соединений в литературе не известна. Способ получения заявляемых соединений отличается от описанного в [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250] метода тем, что окислительную циклизацию N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамидов ведут не при нагревании в труднодоступных и дорогостоящих трифторэтаноле или гексафторизопропаноле, а в широко используемом, многотоннажном хлористом метилене при комнатной температуре. При этом снижаются энергозатраты, увеличивается хемоселективность процесса, что сводит к минимуму побочные реакции и способствует увеличению выходов целевых веществ (см. Табл) и снижению их себестоимости.

Таблица
Условия получения 7-R-3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразинов
Соединение	Заявляемые условия циклизации N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамидов	Условия циклизации N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамидов, описанные в [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250]
Растворитель	Время процесса, ч	Температура процес-са	Выход, %	Растворитель	Время процес са, ч	Температура процесса	Выход, %
I	CH2Cl2	72	25 °C	84	(CF3)2CHOH	7	55	22
II	CH2Cl2	96	25 °C	75	CF3CH2OH	7	75	67
V	CH2Cl2 -
(CF3)2CHOH (9:1)	24	25 °C	83	CF3CH2OH + ДМФА (1:1)	7	75	68
Аналогом вышеуказанных соединений по строению и действию является 6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-3-этилтио][1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразин (А), препаратом сравнения по действию является изониазид (Б). Синтез вещества А описан [Журн. орган. химии, 1999, 35, 1379], данные по туберкулостатической активности соединения А приведены в публикации [Известия. АН, Сер. Химическая, 2021, N 6, 1093-1098], минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для него равна 0.62 мкг/мл.

Раскрываемые в настоящем изобретении соединения I-VI отличаются от известного и близкого по структуре соединения А положениями атомов азота в азольной части гетероциклической системы и заместителями: вместо этилтио- реализуются метил-, или 2-пиридил, или пиразол-1-ил, или [1,2,4]триазол-1-ил, или 3-нитрофенил. Азиновый цикл содержит 3,5-диметилпиразол-1-ил, или метокси, или этокси, или изопропокси, или солевую форму гидроксигруппы (NaO).

Препарат сравнения по действию, изониазид формулы Б, является селективным противотуберкулезным препаратом, однако недостатками этого препарата являются его высокая токсичность и различные побочные эффекты при применении. Изониазид вызывает аллергию, негативно влияет на функцию желудочно-кишечного тракта, имеет побочное действие на нервную систему [М. Д. Машковский. Лекарственные средства, 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: РИА «Новая волна»: издатель Умеренков, 2019, с.856 и Фармакология и токсикология, 1987, 50, (4), с.87]. Отмечено широкое распространение устойчивых к изониазиду клинических штаммов микобактерий [Антибиотики и химиотерапия, 2002, 47, №6, с.28-30].

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Синтез заявляемых производных [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина осуществляют по схеме:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)Стартовый 3,6-ди-(3,5-диметилпиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин получают по известной методике [Coburn, D. G.; Buntain, A.; Harris, B. W.; Hiskey, M. A.; Lee, K. Y.; Ott, D. G. J. Heterocycl. Chem. 1991, 28, 2049]. Структуры заявляемых соединений I-VI подтверждены данными спектроскопии ЯМР 1Н (спектрометр Bruker Avance DRX-400 с рабочей частотой 400 МГц и Bruker Avance-500 с рабочей частотой 500 МГц) и элементного анализа (автоматический анализатор CHN РЕ 2400 сер. II (Perkin Elmer).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

3-(3,5-Диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(2-пиридил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (I).

а) N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)-2-пиридин-1-карбоксиимид-амид получают перемешиванием при комнатной температуре в течение 3-х часов 810 мг (3 ммоль) 3,6-ди(3,5-диметилпиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразина и 473 мг (3 ммоль) -пиридиламидина гидрохлорида в 15 мл ДМФА в присутствии 303 мг (3 ммоль) триэтиламина. К реакционной массе добавляют 30 мл воды, образовавшийся красный осадок N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)- -пиридин-1-карбокси-имидамида отфильтровывают, сушат в течение суток на воздухе. Выход 593 мг (67%), т. пл. 169-170 °C. Спектр ЯМР 1Н (400 МГц, DMSO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 2.27, 2.55 (оба с, 6H, 2CH3); 6.30 (с, 1H, CH в пиразолиле); 7.68-7.71, 8.08-8.12, 8.52-8.54, 8.75-8.77 (все м, 4Н, 4CH в пиридиле); 8.82, 9.03 (оба уш. с, 2H, 2NH). C13H13N9. Вычислено, %: C, 52.87; H, 4.44; N, 42.69. Найдено, %: С, 52.90; Н, 4.31; N, 42.43.

б) К 295 мг (1.0 ммоль) N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)-2-пиридин-1-карбоксиимидамида в 50 мл хлористого метилена добавляют 483 мг (1.5 ммоль) фенилйоддиацетата и выдерживают при перемешивании при комнатной температуре в течение 72 часов, растворитель отгоняют. Остаток перекристаллизовывают из ацетонитрила, получают 197 мг (67% от теор.) Из остатка, выделенного из фильтрата после перекристаллизации, при помощи колоночной хроматографии получают дополнительно еще 50 мг (17%) кристаллического вещества лимонно-желтого цвета с Rf = 0.64 (ацетонитрил-бензол 1:1). Суммарный выход 247 мг (84%), т. пл. 230 °C. Спектр ЯМР 1Н (500 МГц, DMSO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 2.31, 2.64 (оба с, 6H, 2CH3); 6.39 (с, 1H, CH в пиразолиле); 7.69 (дд, J1 = 7.1, J2 = 4.5, 1H, CH в пиридиле) 8.12 (ддд, J1 = 7.8, J2 = 7.1, J3 = 1.7, 1Н, CH в пиридиле); 8.45 (д, J1 = 7.8, J2 = 4.5, 1Н, CH в пиридиле). C13H11N9. Вычислено, %: C, 53.24; H, 3.78.38; N, 42.98. Найдено, %: С, 53.16; Н, 3.67; N, 42.82.

б*) При проведении циклизации в гексафторизопропаноле в условиях, описанных в [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250], из 295 мг (1.0 ммоль) N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)-2-пиридин-1-карбоксиимидамида выделяют при помощи колоночной хроматографии с использованием элюента ацетонитрил-бензол (1:1) 65 мг (22%) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(2-пиридил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина (I).

Пример 2.

3-Метокси-7-(пиразол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (II).

Получают из 282 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(1H-пиразол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного аналогично примеру 1 (б) (время реакции 4 суток, выход 75%), в 5 мл метанола в присутствии 0.1 ммоль (14 мг) карбоната калия при перемешивании на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 4 часов. Осадок отфильтровывают, промывают метанолом. Выход 90 мг (41%), т. пл. 165-167°С. Спектр ЯМР 1Н (500 МГц, DMSO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 4.22 (с, 3Н, ОСН3); 6.77 (дд, J1 = 2.5 Гц, J2 = 1.5 Гц, 1Н, С(4)Н в пиразолиле); 8.04 (д, J = 1.5 Гц, 1Н, CH в пиразолиле); 8.73 (д, J = 2.5 Гц, 1Н, CH в пиразолиле). C7H6N8O. Найдено, %: C, 38.52; H, 2.65; N, 51.54. Вычислено, %: C, 38.54; H, 2.77; N, 51.36.

Пример 3.

3-Метокси-7-(1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (III).

Получают аналогично соединению II (пример 2) из 283 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного по известной методике [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250]. Выход 66 мг (30%), т.пл. >200°С (разл.). Спектр ЯМР 1Н (500 МГц, DMSO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 4.24 (с, 3Н, ОСН3); 8.52, 9.68 (оба с, 2H, 2CH в триазолиле). C6H5N9O. Найдено: C, 32,87; H, 2,19; N, 57,61. Вычислено: C, 32,88; H, 2,30; N, 57,52.

Пример 4.

3-Этокси-7-(1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (IV).

Получают аналогично соединению II (пример 2) из 283 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(1H-1,2,4-триазол-1-ил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного по известной методике [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250], в 5 мл этанола. Осадок отфильтровывают и промывают этанолом. Выход 124 мг (53%), т.пл. 175-177°С. Спектр ЯМР 1Н (500 МГц, DMSO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 1.65 (т, J = 7.1, 3Н, СН3); 4.72 (к, J = 7.1, 2Н, СН2); 8.28, 9.18 (оба с, 2H, 2CH в триазолиле). Найдено, %: C 36.10; H, 3.04; N, 54.35. C7H7N9O. Вычислено, %: C, 36.05; H, 3.03; N, 54.06.

Пример 5.

3-Изопропокси-7-(3-нитрофенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин (V).

Получают аналогично соединению II (пример 2) из 337 мг (1 ммоль) 3-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-7-(3-нитрофенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина, синтезированного аналогично примеру 1 (б) с использованием в качестве растворителя смеси CH2Cl2-(CF3)2CHOH 9:1 (время реакции 24 часа, выход 83%), в 5 мл изопропанола при кипячении в течение 4 часов. Осадок отфильтровывают и промывают изопропанолом. Выход 120 мг (40%), т.пл. 153-155°С. Спектр ЯМР 1Н (400 МГц, CDCl3), δ, м. д. (J, Гц): 1.61 (д, J = 6.2, 6Н, 2СН3); 5.46 (сп, J = 6.2, 1Н, СН, OPri); 7.75-7.79, 8.41-8.44, 8.72-8.74, 9.25-9.26 (все м, 4H, 4CH, Ar). Найдено, %: C 47.88; H, 3.82; N, 32.28. C12H11N7O3. Вычислено, %: C, 47.84; H, 3.86; N, 32.55.

Пример 6.

Натриевая соль 3-гидрокси-7-метил-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина (VI).

3-(3,5-Диметилпиразол-1-ил)-7-метил-[1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразин, синтезированный по известной методике [Beilstein J. Org. Chem. 2022, 18, 243-250], в количестве 230 мг (1 ммоль) суспендируют в 4 мл ацетонитрила, прибавляют 1 мл 1н водного раствора NaOH и выдерживают при 60°С в течение 5 часов. Растворитель удаляют при пониженном давлении и 90°С. Остаток промывают этиловым спиртом, отфильтровывают, сушат в течение 3 ч при 90°С. Выход 105 мг (60%), т.пл. >335°С (разл.). Спектр ЯМР 1Н (500 МГц, DMSO-d6), δ, м. д. (J, Гц): 2.37 (с, 3Н, СН3). C4H3N6NaO×H2O. Вычислено, %: C, 25.01; H, 2.62; N, 43.75. Найдено, %: C, 25.04; H, 2.59; N, 44.15.

Изучение антимикобактериальной активности соединений проводили на основе REMA метода [Palomino, J. Resazurin Microtiter Assay Plate: Simple and Inexpensive Method for Detection of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis / J.Palomino, A.Martin, M.Camacho, H.Guerra, J.Swings, F.Portaels // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46. - N 8. - P. 2720-2722 DOI: 10.1128/AAC.46.8.2720-2722.2002; Taneja, N. Resazurin reduction assays for screening of anti-tubercular compounds against dormant and actively growing Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis / N.Taneja, J.Tyagi // J. Antimicrob. Chemother. - 2007. - Vol. 60. - P. 288-293 DOI:10.1093/jac/dkm207].

Приготовление суспензии МБТ. Суспензию МБТ с оптической плотностью 1.0 ед. по МакФарланду готовили (с использованием физиологического раствора) из культуры Mycobacterium tuberculosis H37Rv, находящейся в логарифмической фазе роста на питательной среде Левенштейна-Йенсена. 50 мкл полученной суспензии переносили в пробирку с питательным бульоном 7Н9 и ростовой добавкой OADC. В лунки планшетов вносили по 100 мкл полученной суспензии.

Приготовление разведений исследуемых соединений. Разведения исследуемых соединений готовили с использованием ДМСО. Изониазид растворяли только в воде.

Навеску 10 мг исследуемого соединения растворяли в 5 мл ДМСО, получая базовый раствор с концентрацией исследуемого соединения 2000 мкг/мл. Далее выполняли последовательные двукратные разведения с использованием в качестве разбавителя чистого ДМСО.

Процедура исследования:

В лунки 96-луночного планшета вносили по 97 мкл питательной среды и по 3 мкл растворов исследуемых соединений, приготовленных, как описано выше. Далее в лунки планшетов вносили по 100 мкл суспензии МБТ. Таким образом, в лунках планшета получены растворы исследуемых соединений в следующих концентрациях: 30, 15, 7.5, 3.75, 1.88, 0.94, 0.47, 0.23 мкг/мл. Концентрация ДМСО во всех лунках 1.5% (об.).

В качестве положительного контроля использовали культуру МБТ без добавления соединений и с добавлением ДМСО (конечная концентрация 1.5%). В качестве препарата сравнения использовали изониазид.

Планшеты инкубировали при 37 °С в течение 7 суток. По истечении времени инкубации в лунки вносили по 30 мкл раствора резазурина (с добавлением Tween 80) и продолжали инкубацию при 37 °С. Результат учитывали 72 часа. За МИК принимали минимальную концентрацию исследуемого соединения, предотвращающую изменение окраски резазурина.

Приведённые значения МИК получены в результате двух независимых экспериментов.

Туберкулостатическая активность некоторых триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразинов
Шифр	Соединение	МИК, мкг/мл	Шифр	Соединение	МИК, мкг/мл
I	Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)	0.94	IV	Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)	<31.25
II	Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)	1.88	V	Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)	0.94
III	Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)	3.75	VI	Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)	3.10
Изониазид	0.03
Результаты получены в рамках реализации проекта Минобрнауки «Медицинская химия в создании лекарств нового поколения для лечения социально-значимых болезней» (грант № 075-15-2020-777).

Формула изобретения

1. 3,7-дизамещенные [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразины формулы I-VI

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

где:

R = 2-пиридил, R1 = 3,5-диметилпиразол-1-ил (I);

R = пиразол, R1 = метокси (II);

R = 1,2,4-триазол-1-ил, R1 = метокси (III);

R = 1,2,4-триазол-1-ил, R1 = этокси (IV);

R = 3-нитрофенил, R1 = изопропокси (V);

R = метил, R1 = ONa (VI),

обладающие антибактериальной активностью.

2. Способ получения соединений по п.1, заключающийся в осуществлении синтеза по схеме:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

и отличающийся тем, что стадию окислительной циклизации N-(6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-1,2,4,5-тетразин-3-ил)имидамида проводят в хлористом метилене при комнатной температуре.
фармацевтическая химия
Диана
Вахрушева
Владимировна
Зав.научным отделом
Кандидат биологических наук
Доцент
R-4409-2017
57200506269
622838
https://publons.com/researcher/2032148/diana-vakhrusheva/
0000-0001-6085-6466
РОССИЯ
Ирина
Васильева
Анатольевна
Директор
РОССИЯ
31.21.27
Гетероциклические соединения
76.29.53
Туберкулез
01.04.EE
CHEMISTRY, ORGANIC
03.03.NN
INFECTIOUS DISEASES
Диана
Вахрушева
Владимировна
РОССИЯ
Светлана
Красноборова
Юрьевна
РОССИЯ
Данила
Беляев
Владимирович
РОССИЯ
Наталья
Еремеева
Ивановна
РОССИЯ
Геннадий
Русинов
Леонидович
РОССИЯ
МИНЗДРАВ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1127746460896
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБУ "НМИЦ ФПИ" Минздрава России
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Министерства здравоохранения Российской Федерации
1026605629412
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения