Способ выявления мутаций, приводящих к резистентности у Mycoplasma genitalium к антибиотикам фторхинолонового ряда
Mycoplasma genitalium parC QRDR мутации фторхинолоны
предложен способ выявления мутаций, включающий выделение ДНК из клинических образцов, ПЦР-амплификацию участков генов parC и gyrA QRDR с использованием мультиплекс варианта ПЦР в режиме реального времени, двух пар праймеров и одного зонда для каждого детектируемого локуса, а именно позиций 83-87 QRDR parC и gyrA M. genitalium, с последующим этапом плавления зондов, при этом визуально оценивают пики по каналам FAM и JOE (R6G), сравнивают температуры плавления (Tm) полученных пиков с контрольными образцами и делают вывод о наличии или об отсутствии мутаций WT-«дикий фенотип». Для амплификации используют специальную полимеразу SNP-detect и прибор Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: начальная инкубация 15 мин. при 95°С; затем 55 циклов: 20-сек. денатурации при 95°С и 15-сек. отжига-элонгации при 55°С с детекцией флуоресценции на каналах FAM и JOE (R6G); анализ кривых плавления с начальной инкубацией 2 мин. при 40°С и последующим повышением температуры на 1°С каждые 10 сек. до 77°С с детекцией флуоресценции на канале FAM и JOE (R6G). Для детекции мутаций в QRDR parC и gyrA M. genitalium, включающих позиции 83-87, разрабатывают, два реверсных праймера: Mge_parC_Rpm1 GCTTTGGGACATTCTGATAATTG и Mge_gyrA_Rpm GTCTTGAGCCATTCTTGACA(T-BHQ1)G, которые располагаются непосредственно перед областью связывания зонда и содержат внутренний нефлуоресцирующий гаситель флуоресценции (BHQ1) и в процессе реакции формируют цепь ДНК, комплементарную зонду. Для детекции целевой последовательности, разрабатывают два олигонуклеотидных зонда, содержащих флуорофоры (FAM и R6G) на 3’-конце и полностью комплементарные последовательностям генов parC и gyrA дикого типа. Мутации в участках генов parC и gyrA выявляют с помощью постамплификационного анализа кривых плавления зондов: образцы, содержащие замены в области связывания зонда, имеют сниженную аффинность и меньшую Tm зонда.
медицина, биология, лабораторная диагностика
Инна
Эйдельштейн
Александровна
Заведующий лабораторией молекулярной диагностики НИИАХ
Кандидат биологических наук
Отсутствует
Т-4869-2018
6603248119
РОССИЯ
Роман
Козлов
Сергеевич
Ректор
РОССИЯ
76.31.29
Клиническая фармакология
76.35.33
Лабораторное дело
76.03.43
Медицинская микробиология
01.06.QU
MICROBIOLOGY
03.01.TU
PHARMACOLOGY & PHARMACY
Андрей
Романов
Вячеславович
отработка протокола амплификации на контрольной панели образцов, секвенирование проб
РОССИЯ
МИНЗДРАВ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1127746460896
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБОУ ВО СГМУ Минздрава России
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
1026701435848
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения