Набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций РЬ-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе
МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИНВЫЕ НОВООБРАЗОВАНИЯ СОМАТИЧЕСКИЕ МУТАЦИИ JAK2 CALR MPL
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии молекулярной диагностики миелопролиферативных новообразований. Предложен набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований в генах JAK2, CALR и MPL и способ диагностики на его основе. Отличительной особенностью набора является использование оригинальных комбинаций специфичных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов в двух реакционных смесях. Первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6. Вторая смесь содержит праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10. Изобретение позволяет проводить одновременное исследование пяти мутаций в одной аналитической серии, используя всего две пробирки с реакционными смесями, что приводит к экономии используемого для анализа объема биологического образца, реактивов и времени выполнения анализа. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл.


Группа изобретений относится к области медицины, в том числе к диагностике онкогематологических заболеваний, и предназначена для использования при проведении молекулярно-генетических исследований в клинико-диагностических лабораториях с целью выявления генетических маркеров хронических Ph-негативных миелопролиферативных новообразований.

В соответствии с клиническими рекомендациями [Barbui Т., Thiele J., Gisslinger Н., Finazzi G., Vannucchi A.M, Tefferi A. The 2016 revision of WHO classification of myeloproliferative neoplasms: Clinical and molecular advances. Blood Reviews, 2016. 30: 453-459] основным диагностическим критерием для постановки диагноза Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, а именно истинной полицитемии (ИП), эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) и первичного миелофиброза (ПМФ) является выявление одной из пяти наиболее частых патогенетических соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2 V617F), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143del и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K).

Наиболее распространенные в практике клинико-диагностических лабораторий методы и наборы реагентов для детекции мутаций предусматривают возможность проведения исследования только мутаций в отдельных генах, выполнение полного лабораторного тестирования всех основных мутаций ассоциированных с миелопролиферацией занимает достаточно большой промежуток времени.

Известно одновременное исследование различных мутаций в разных генах с использованием методов секвенирования ДНК [Langabeer SE, Andrikovics Н, Asp J, et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms. Eur J Haematol. 2015, 95:270-279] и микрочипов (https://tools.mermofisher.com/content/sfs/brochures/genomewide_snp6_datasheet.pdf).

Однако требования к оборудованию и квалификации персонала, а также высокая трудоемкость выполнения и стоимость тестирования осложняет широкое использование данных методов в реальной практике клинико-диагностических лабораторий.

Известен способ, который заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченных проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд [RU, пат. 2445373, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.2012 г., бюл. №8].

Недостатки способа заключаются в невозможности проведения мультиплексной реакции в виду использования одного флуоресцентного зонда общего для двух анализируемых аллелей.

Наиболее близким к заявляемому набору реактивов и способу диагностики на его основе по совокупности признаков является набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предусматривавший использование при выполнении мультиплексной полимеразной цепной реакции четырех реакционных смесей, включающих специфические праймеры и TaqMan зонды [RU пат. 2679653, МПК G01N 33/533, опубл. 12.02.2019, Бюл. №5 (прототип)]. В патенте 2679653 предложен набор, содержащий специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды. Праймеры имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-): JAK2-W-F, JAK2-W-R, JAK2-W-P, JAK2-M-F, JAK2-M-R, JAK2-M-P, CALR-1-F, CALR-1-R, MPL-K-F, MPL-K-R, CALR-1-P, MPL-K-P, CALR-2-F, CALR-2-R, MPL-L-F, MPL-L-R, CALR-2-P, MPL-L-P. В TaqMan зондах на 5' конце применяют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX). Для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце. Данное техническое решение позволяет проводить одновременное исследование нескольких мутаций в одной аналитической серии, что приводит к результату в более короткие сроки. А также обеспечивает точную диагностику хронических Ph-негативных миелопролиферативных опухолей, позволяет выявлять группу пациентов с наличием сочетанных патогенетических мутаций.

Однако при использовании вышеуказанного набора необходимо на каждую анализируемую пробу использовать четыре реакционные смеси требующие не менее 4 отдельных пробирок, что ограничивает производственные ресурсы лаборатории, особенно при больших объемах тестирования.

Задача изобретения - разработка набора реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций в генах JAK2, CALR и MPL, а также ускоренного и экономичного способа диагностики Ph- негативных миелопролиферативных новообразований на его основе.

Техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является изготовление набора реактивов для выявления пяти соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2 V617F), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143de1 и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K) методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, сокращение рабочего времени на выполнение лабораторных тестов и экономия расходных материалов.

Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту набор реактивов достигается тем, что в наборе реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, содержащем специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют красители: флуоресцеин (FAM), и хлорированный флуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце, новым является то, что для анализа одного биологического образца используют две реакционные смеси, при этом первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, а вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10 и имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: ССТСАТССТССТСАТССТСА,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-Р10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,

дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.

Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту способу достигается также и тем, что в способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающем проведение мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буфера, дНТФ, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы, MgCI2; и воды в оптимальных объемах, с последующей амплификацией которую проводят в следующем режиме: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы, включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд, отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз, новым является то, что мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят одновременно в двух реакционных смесях, первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515К, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10, имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):

JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,

JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,

JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,

CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,

CALR-R: CCTCATCCTCCTCATCCTCA,

CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,

CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA

515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,

515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,

515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,

515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,

дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце, а результат признают положительным, если значение порогового цикла (Ct) для образца не больше 35.

Заявляемая группа изобретений соответствует требованию единства изобретения, поскольку группа разнообъектных изобретений образует единый изобретательский замысел, причем один из заявляемых объектов - набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предназначен для использования в другом - способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, при этом оба объекта группы изобретений направлены на решение одной и той же задачи с получением единого технического результата.

Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков для каждого из заявляемых объектов группы, изложенных в формулах. Следовательно, каждый из объектов группы изобретений соответствует критерию «новизна».

Из литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о способе мультиплексного ПЦР-анализа и (или) наборе реактивов для одновременного выявления отдельных патогенетических соматических мутаций V617F, с. 1092_1143del, с. 1154_1155insTTGTC, W515L, W515K в генах JAK2, CALR и MPL с использованием всего двух реакционных смесей для одной биологической пробы, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».

Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов.

На фиг. 1 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы без соматических мутаций: 1 - аллель "дикого типа" JAK2.

На фиг. 2 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы с одной из пяти соматических мутаций: 1 - аллель "дикого типа" JAK2, 2 - мутация JAK2 V617F.

На фиг. 3 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы одновременно с двумя соматическим мутациями: 1 - аллель "дикого типа" JAK2, 2 - мутация JAK2 V617F, 3 - CALR 1 типа (с.1092_1143del).

Способ осуществляется следующим образом.

Мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят в смеси объемом 25 мкл на 1 пробу ДНК. Для каждого анализируемого образца ДНК пациента готовят 2 пробирки, в которые вносят реакционные смеси, соответствующие номеру пробирки (таблица 1). В каждую пробирку добавляют Taq-полимеразу (5 ед/мкл) в объеме 0,5 мкл, а затем ДНК исследуемого образца с концентрацией не менее 40 нг в объеме 10 мкл. При каждом исследовании необходимо использовать две дополнительные пробирки, в которые вместо ДНК вносят контрольные образцы ПКО (положительный контрольный образец) и ОКО (отрицательный контрольный образец). ПКО представляет собой человеческую геномную ДНК с наличием мутантных аллелей всех исследуемых генов. ОКО представляет собой человеческую геномную ДНК здорового донора, не имеющего мутаций в исследуемых генах.
Набор реактивов позволяет выявлять соматические мутации для диагностики миелопролиферативных новообразований, при этом время анализа сокращается в два раза. Набор может быть использован в клинико-диагностических лабораториях и научно-исследовательских организациях.
76.09.99
Прочие материалы медицинского назначения
76.35.33
Лабораторное дело
Игорь
Ольховский
Алексеевич
"Кандидат медицинских наук"
"Доцент"
"0000-0003-2311-2219"
РОССИЯ
Герман
Шипулин
Александрович
"Кандидат медицинских наук"
"Отсутствует"
"J-1167-2014"
"6602099850"
"87358"
"0000-0002-3668-6601"
РОССИЯ
Алексей
Горбенко
Сергеевич
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"750470"
"0000-0001-8756-2660"
РОССИЯ
Марина
Столяр
Александровна
"Отсутствует"
"Отсутствует"
"М-4837-2016"
"56180342600"
"689087"
"0000-0002-8037-9844"
РОССИЯ
ФГБУ "ЦСП" ФМБА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ЦЕНТР СТРАТЕГИЧЕСКОГО ПЛАНИРОВАНИЯ И УПРАВЛЕНИЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИМИ РИСКАМИ ЗДОРОВЬЮ" ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА
1027700168495
СЕРГЕЙ
ЮДИН
МИХАЙЛОВИЧ
Организация
Федеральное медико-биологическое агентство
Федеральные государственные бюджетные учреждения
ФГБУ "ЦСП" ФМБА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ЦЕНТР СТРАТЕГИЧЕСКОГО ПЛАНИРОВАНИЯ И УПРАВЛЕНИЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИМИ РИСКАМИ ЗДОРОВЬЮ" ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА
1027700168495
СЕРГЕЙ
ЮДИН
МИХАЙЛОВИЧ
Организация
Федеральное медико-биологическое агентство
Федеральные государственные бюджетные учреждения
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ФОРМУЛА ГЕНА"
1172468011682
АЛЕКСЕЙ
ГОРБЕНКО
СЕРГЕЕВИЧ
Организация
Организации, учрежденные юридическими лицами или гражданами, или юридическими лицами и гражданами совместно
Общества с ограниченной ответственностью