МОЛЕКУЛА РНК-ПРОВОДНИКА ДЛЯ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ ПРОТОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА VRN-A1 ОДНОДОЛЬНЫХ ЗЕРНОВЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9
молекула РНК-проводника для геномного редактирования промоторной области гены VRN-A1 однодольных зерновых культур система редактирования генома CRISPR/Cas9
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к молекуле РНК-проводника для целенаправленного воздействия на нуклеотидную последовательность консервативного участка промоторной области гена VRN-A1 однодольных зерновых культур системами редактирования генома CRISPR/Cas9. Изобретение позволяет эффективно получать новые аллели генов VRN1, имеющих мутации в регуляторных областях гена на неизменном генетическом фоне. 10 ил., 3 пр.


Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии растений, более конкретно к РНК-проводнику (молекуле направляющей РНК со специфичной нуклеотидной последовательностью) для контролирования экспрессии генов растений путем целенаправленного воздействия на нуклеотидную последовательность консервативного участка промоторной области гена VRN-A1 однодольных зерновых культур системами редактирования генома CRISPR/Cas9, в которых молекулы РНК-проводника или сконструированный на его основе экспрессионный ДНК-вектор являются одним из компонентов.

Предшествующий уровень техники

Способность злаков переходить к репродуктивному развитию зависит от функционирования двух основных систем генов развития - VRN (vernalization - ответ на яровизацию) и PPD (photoperiodic - чувствительность к фотопериоду). У представителей Triticeae чувствительность к яровизации контролируется группой скоординировано функционирующих генов VRN1, VRN2 и VRN3. Важнейшая роль в регуляции ответа на яровизацию принадлежит гену VRN1, кодирующему MADS-box транскрипционный фактор (Trevaskis et al., 2007), который необходим для закладки и поддержания флоральной меристемы в точке роста побега пшеницы. У озимых форм потребность в яровизации связана с тем, что VRN1 гены находятся в рецессивном состоянии и их экспрессия блокирована до наступления периода воздействия пониженных температур. Для перехода озимой пшеницы к репродуктивному развитию необходимо, чтобы уровень транскрипта VRN1 достиг определенного порогового значения (Loukoianov et al., 2005).

Отсутствие потребности в яровизации у яровых сортов связано с существенными изменениями нуклеотидной последовательности промотора или первого интрона гена VRN-A1 (Yan et al. 2004; Fu et al. 2005). Показано, что промотор генов VRN1 содержит консервативные цис-элементы (CArG-, VRN- и G-боксы), представляющие собой мишени для транскрипционных факторов, участвующих в ответе на яровизацию. Известен ряд нуклеотидных модификаций промотора VRN-A1 (Konopatskaia et al., 2016; Muterko et al. 2016) (Фиг. 1). Наиболее распространенный доминантный аллель Vrn-A1a отличается от рецессивного аллеля vrn-A1 транспозонными вставками повторяющихся последовательностей в VRN-box участке промотора (Фиг. 1). Другие доминантные аллели содержат делеционные фрагменты разной протяженности в различных участках, таких как VRN-box (аллели Vrn-A1b, Vrn-A1d, Vrn-A1e), CArG-box (аллели Vrn-A1e), G-box (аллели Vrn-A1f), а также делении размером 20 п.н. в участке между -136 и -157 п.н. (аллели Vrn-A1b, Vrn-A1d) или крупную делецию размером 50 п.н. в участке между -62 и -112 п.н. (аллели Vrn-A1f) (Фиг. 1). Помимо делеций, доминантные аллельные варианты Vrn-A1b, Vrn-A1d, Vrn-A1e также могут содержать единичные нуклеотидные замены в VRN-box участке промотора (Фиг. 1). Крупная деления размером 50 п.н. в участке между -62 и -112 п.н. а также 8 п.н. нуклеотидная делеция в G-box была обнаружена только у аллеля Vrn-A1f яровых диких видов пшеницы секции Timopheevii (Фиг. 1), и не присутствует у представителей современных культурных видов мягкой и твердой пшеницы (Muterko et al. 2016). Примечательно, что в настоящий момент не обнаружены какие либо природные яровые и озимые формы пшеницы с измененной последовательностью промотора VRN1 в области между -113 и -122 п.н., а также отсутствуют искусственные мутантные формы зерновых с модификациями промотора VRN1 в областях между -62 и -120 п.н.

Время от посева до колошения имеет важное практическое значение для производителей пшеницы, поэтому значительные усилия селекционеров направлены на сокращение вегетационного периода у культурных сортов пшеницы. Возможность контролировать сроки колошения путем точечного изменения аллелей VRN1 позволит упростить процесс получения новых высокопродуктивных сортов, соответствующих современным требованиям. Получения новых (или аналогичных диким представителям) аллелей генов VRN1, имеющих мутации в регуляторных областях гена на неизменном генетическом фоне, представляет собой техническую проблему, для решения которой необходимо расширение арсенала средств, доступных селекционерам. Настоящее изобретение решает эту проблему путем изменения последовательности промотора VRN1 средствами редактирования геномов растений CRJSPR/Cas9.

Основными компонентами системы редактирования CRISPR/Cas9 являются белок Cas9, обладающий нуклеазной активностью, и РНК-проводник (sgRNA, направляющая РНК специфичной композиции), которая направляет белок Cas9 к специфичному участку-мишени генома растений. РНК-проводник функционирует в качестве матрицы при редактировании ДНК и представляет собой химерную последовательность с элементами распознавания белка Cas9 и участка, комплементарного ДНК-мишени генома растения. Вследствие этого РНК-проводник состоит из двух областей - константной, длиной около 70 нуклеотидов, и вариабельной, длиной 17-25 нуклеотидов. Первая отвечает за образование функционального комплекса Cas9-sgRNA, а вариабельная - за специфичное связывания этого комплекса с целевой последовательностью ДНК в геноме (Jinek et al., 2012; Nishimasu et al., 2014). Наиболее распространенная система использует РАМ, состоящий из трех оснований NGG, он распознается нуклеазой Cas9 из Streptococcus pyogenes (Hsu et al., 2014; Mao et al., 2013). Разрезание целевой мишени возможно только при условии совпадения мишени и наличия проксимального участка 5' РАМ-мотива, прилегающего к протоспейсеру.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является разработка РНК-проводников (направляющих РНК со специфичной нуклеотидной последовательностью), которые могут быть использованы в системах CRISPR/Cas9 для внесения изменений в консервативный участок протяженностью 50 п.н. между -62 и -112 п.н. промоторной области гена VRN-A1 (Фиг. 1) без изменения других участков генома зерновых.

Задача решается, а технический результат достигается созданием молекулы РНК-проводника, где указанный РНК-проводник содержит первую нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 и вторую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, фланкирующую первую последовательность с 3'-конца и представляющую собой РНК-шпильку, при этом указанная первая последовательность обеспечивает связывание с целевым высококонсервативным участком промотора гена VRN-A1, а указанная вторая последовательность способна распознаваться РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas9 с обеспечением внесения мутаций в целевой участок.

Принцип функционирования предлагаемых РНК-проводников базируется на особенностях работы системы CRISPR/Cas9. Нуклеаза Cas9 взаимодействует с представленными в настоящей заявке направляющими молекулами РНК-проводников, в результате чего образуется функциональный комплекс, который нацеливает белок Cas9 в специфическое местоположение внутри целевой последовательности промотора гена VRN-A1, комплементарной участку РНК-проводника. В результате такого взаимодействия функциональные домены комплексы CRISPR/Cas9 вносят разрывы в обе цепи ДНК, которые в дальнейшем восстанавливаются репарационными системами клетки. В отсутствии матрицы репарация проводится за счет негомологичного соединения концов (NHEJ, non-homologous end joining). При этом в месте разрыва могут происходить вставки или делеции нуклеотидов, что вероятно приведет к образованию мутантных вариантов последовательности промотора гена VRN-A1.

В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает возможность применения разрабатываемого РНК-проводника непосредственно в виде молекулы РНК и использование его в работах по геномному редактированию в составе рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП), т.е. в системах CPJSPR/Cas9 где комплекс Cas9-sgRNA может быть представлен в виде очищенного функционального белка Cas9 в смеси с молекулами РНК-проводника.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает создание ДНК-векторов для интродукции в геном однодольных зерновых культур последовательности разрабатываемого РНК-проводника с целью его стабильной экспрессии в отдельных клетках, тканях и растениях в результате генетической трансформации.
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает возможность применения разрабатываемого РНК-проводника непосредственно в виде молекулы РНК и использование его в работах по геномному редактированию в составе рибонуклеопротеиновых комплексов (РНП), т.е. в системах CPJSPR/Cas9 где комплекс Cas9-sgRNA может быть представлен в виде очищенного функционального белка Cas9 в смеси с молекулами РНК-проводника.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает создание ДНК-векторов для интродукции в геном однодольных зерновых культур последовательности разрабатываемого РНК-проводника с целью его стабильной экспрессии в отдельных клетках, тканях и растениях в результате генетической трансформации.
Дмитрий
Мирошниченко
Николаевич
старший научный сотрудник
Кандидат биологических наук
Отсутствует
-
6602479664
138950
РОССИЯ
Геннадий
Карлов
Ильич
Директор
РОССИЯ
34.23.57
Генетика и селекция растений
01.06.KM
GENETICS & HEREDITY
Сергей
Долгов
Владимирович
Исполнитель
РОССИЯ
Вадим
Тимербаев
Рафаилович
Исполнитель
РОССИЯ
Ольга
Шульга
Альбертовна
Исполнитель
РОССИЯ
Анна
Клементьева
Александровна
Исполнитель
РОССИЯ
Елена
Салина
Артемовна
Исполнитель
РОССИЯ
Дмитрий
Мирошниченко
Николаевич
Руководитель
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБНУ ВНИИСБ
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной   биотехнологии»
1037739342123
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения