Способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга
сердечно-сосудистая система неврология ишемический инсульт головного мозга
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает новый способ персонифицированной превентивной генной терапии пациента при высоком риске инсульта путем внутривенной инфузии аутологичиого лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, который готовят на основе лейкоцитов периферической крови пациента и репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущих последовательности гена сосудистого эндотелиалыюго фактора роста VEGF165 человека, гена глиального нейротрофического фактора GDNF человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии NCAM1 человека. 2 ил., 1 пр.


Изобретение относится к области медицины в неврологии, в частности к методу персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга для сдерживания негативных последствий в области ишемического повреждения при наступлении инсульта.

По данным Всемирной организации здравоохранения ишемические церебральные инсульты занимают ведущее место среди причин смертей в мире. В России частота инсульта составляет около 500 случаев на 100 тыс. населения. Причем, до 84-87% случаев пациенты с инсультом умирают или остаются инвалидами и лишь 8-10% случаев заканчиваются восстановлением нарушенных функций мозга в первые 3 недели заболевания. Поэтому, профилактика инсульта является не только медицинской, но и социально-экономической проблемой. Медицинские меры профилактики инсульта направлены на предотвращение факторов риска, которые включают в себя коррекцию заболеваний сердечно-сосудистой системы, обмена веществ, гемостаза и др. Особенно важное значение превентивная терапия инсульта имеет в первые часы после возникновения сосудистой катастрофы для предотвращения массовой гибели нейронов. Вокруг первичного очага ишемического инфаркта с необратимыми патоморфологическими сдвигами формируется периинфарктная область - «ишемическая полутень» или «пенумбра», кровоснабжение в которой существенно ниже нормального уровня. Жизнеспособность нейронов в этой области сохраняется в течение 3-6 часового периода, так называемого «терапевтического окна», во время которого имеется возможность усилить свойства нейропластичности мозга и повысить жизнеспособность нейронов в условиях ишемии. Таким образом, превентивная терапия при угрозе инсульта, может быть эффективным способом предупредить распространение инфаркта на пограничные с первичным очагом некроза области ткани мозга (ишемическую полутень) в период терапевтического окна. При этом превентивной терапии, нацеленной на сдерживание постишемических повреждений мозга при наступлении инсульта, не существует.

В настоящее время в эксперименте для терапии нейродегенеративных заболеваний, нейротравм и инсультов активно разрабатываются геннотерапевтические препараты с нейропротекторным действием или для стимулирования нейрорегенерации. Множество различных генетических конструкций было разработано в зависимости от типа генетического вектора и загруженной в вектор рекомбинантной кДНК, кодирующей терапевтическую молекулу (doi:10.1002/jnr.20968). Члены семейства нейротрофинов (NGF, BDNF, NT-3 и NT-4/5), семейства глиальных нейротрофических факторов (GDNF, ньютурин, артемин, персефин), семейство нейропоэтических цитокинов (CNTF, LIF, IL-6), семейства сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGF-A, фактор роста плаценты (PGF), VEGF-B, VEGF-C и VEGF-D), семейства инсулиноподобных факторов роста (IGF-1, IGF-2) и семейства нейрональных молекул клеточной адгезии (NCAM, L1) широко используют для коррекции заболеваний центральной нервной системы. По способу доставки геннотерапевтического препарата в организм пациента различают прямую генную терапию (in vivo), предполагающую непосредственное введение генетической конструкции, и клеточно-опосредованную генную терапию (ex vivo), при которой для доставки терапевтического гена используют клеточные носители.

Преимущественно работы с применением геннотерапевтических препаратов направлены на лечение инсульта после его возникновения. Целесообразность использования генной терапии при ишемическом инсульте головного мозга доказана в многочисленных доклинических исследованиях в моделях на лабораторных животных [http://dx.doi.org/10.1517/17425247.2016.1144588]. Из исследованного уровня техники известны способы доставки рекомбинантных терапевтических генов с нейропротекторным действием с помощью различных векторных систем путем инъекции геннотерапевтического препарата в цереброспинальную жидкость или непосредственно в ткань мозга до или после моделирования инсульта (doi: 10.3389/fnmol.2016.00034).

Для лечения инсульта в острую фазу известен способ одновременной интратекальной инфузии рекомбинантных генов, кодирующих нейротрофические факторы VEGF, GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, с помощью аденовирусных векторов пятого серотипа (Ad5), или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека (Патент RU №2676701, МПК A61K 31/7088 - 10.01.2019, БИ №1).

В другом исследовании с целью превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга крысы представлен способ интратекальной доставки комбинации рекомбинантных генов, кодирующих нейротрофические факторы VEGF, GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, с помощью аденовирусных векторов пятого серотипа (Ad5), или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека для повышения жизнеспособности нейронов при угрозе инсульта и, таким образом, сдерживания массовой гибели нервных клеток период «терапевтического окна» в области ишемической полутени в случае наступления инсульта (Патент RU №2748940, МПК A61K 31/7088, A61K 48/00, А61Р 9/10, А61Р 43/00 - 01.06.2021, Бюл. №16). При этом доставка генов с помощью клеточных носителей (клеточно-опосредованная, ex vivo генная терапия) считается более безопасной, при которой отсутствует неуправляемая трансдукция различных клеток тканей и органов, а также прямое токсическое и иммуногенное действие вирусного вектора на организм реципиента, как в случае прямой (in vivo) генной терапии (doi:10.3390/ijms21186858).

Однако в уровне техники приведенных выше примеров для безопасной превентивной генной терапии существует необходимость использования аллогенных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, а введение генно-клеточного препарата осуществляют путем интратекальной инъекции в цереброспинальную жидкость. Недостатком использования мононуклеарных клеток крови пуповины человека в качестве клеточных носителей терапевтических генов являются существенные ограничения для их активного применения в практической медицине, связанные как с недостаточным количеством клеточного материала, который забирается и хранится в криобанках персонально для донора, так и с рисками аллотрансплантации. Интратекальная инъекция в цереброспинальную жидкость лекарственных средств посредством люмбальной пункции - сложная инвазивная манипуляция, которую в условиях стационара выполняет опытный специалист, и для превентивной генной терапии такой способ введения геннотерапевтического препарата не может быть применен для широкого использования.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами, кодирующими VEGF, GDNF и NCAM, для генио-клеточной терапии инсульта головного мозга в острую фазу (Патент RU №2784233, МПК A61K 48/00, A61K 35/12, А61Р 9/10, А61Р 25/02 - 23.11.2022, Бюл. №33). Данный способ предполагает использование собственных лейкоцитов пациента как в качестве носителей генов, кодирующих нейротрофические факторы, так и продуцентов рекомбинантных терапевтических молекул в организме пациента для сдерживания развития ишемического повреждения мозга. Эффективность генетически модифицированного аутологичного лейкоконцентрата доказана в моделях на мини-свиньях с моделью ишемического инсульта головного мозга при внутривенном введении генно-клеточного препарата в период терапевтического окна.

Однако на сегодняшний день способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга с помощью аутологичных лейкоцитов, продуцирующих рекомбинантные нейропотекторные факторы не известен.

Задачей настоящего изобретения является решение перечисленных проблем, связанных с клеточным носителем терапевтических генов и способа введения генно-клеточного препарата для превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого, экономичного и эффективного способа персонифицированной превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга путем внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного терапевтическими генами, при высоком риске наступления инсульта.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что в предложенном способе превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга используют аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный искусственным генетическим материалом, для временной продукции рекомбинантных факторов с нейропротекторным действием, повышающих нейропластичность мозга и способных предупредить массовую гибель нейронов в области пенумбры в период терапевтического окна, при возможном наступлении ишемического инсульта. Для получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного искусственным генетическим материалом - лейкоконцентрат получают из цельной крови пациента и трансдуцируют с помощью фармацевтической композиции, в состав которой входят три репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека. При высоком риске ишемического инсульта из лейкоконцентрата пациента и фармацевтической композиции готовят обогащенный рекомбинантными генами vegf165, gdnf и ncam1 лейкоконцентрат, который вводят путем внутривенной инфузии для сдерживания массовой гибели нейронов в области пенумбры (ишемической полутени) при наступлении инсульта.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:

Фиг. 1 - данные, полученные при анализе поведенческого теста «Открытое поле». Результаты горизонтальной активности у контрольных и опытных мини-свиней представлены в процентном отношении к базовому уровню, принятому за 100%, до моделирования инсульта (Тренировка) и на 3, 7 и 14 и 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Сплошная линия показывает изменения показателей поведенческого теста у контрольных животных, пунктирная линия - у опытных животных.

Фиг. 2 - результаты морфометрического анализа объема (см3) инфаркта головного мозга контрольных и опытных мини-свиней через 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Серый прямоугольник соответствует данным контрольных животных, белый - опытных мини-свиней. Поперечные линии внутри прямоугольников - медиана значений, границы прямоугольников - 1-ый и 3-ий квартили, Т-образные линии, выходящие из прямоугольников - минимальные и максимальные наблюдаемые значения.

Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется нижеприведенным примером использования аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией, для превентивной генной терапии ишемического инсульта в модели на мини-свиньях.

Пример получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно фармацевтической композицией, содержащей композицию из трех репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека, и его использования для персонифицированной превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях.

В примере были использованы самки вьетнамских вислобрюхих мини-свиней весом 20-25 кг (n=8). Протоколы анестезии, оперативных вмешательств, послеоперационного ухода и эвтаназии животных одобрены Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинског о университета (№5 от 26 мая 2020 года). Дизайн экспериментов включает в себя следующие этапы:

Этап I. Изготовление аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами, кодирующими VEGF165, GDNF и NCAM1.

У подопытных мини-свиней под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно, в асептических условиях из подключичной вены забирали 50 мл крови в контейнеры для крови (гемакон), содержащие 35 мл антикоагулянта (ЦФДА-1) и процессировали для получения лейкоконцентрата по известному способу (Патент RU №2716013, МПК A61K 48/00, A61K 35/00, опубл. 05.03.2020, Бюл. №7). Далее, полученный лейкоконцентрат, обогащали искусственным генетическим материалом с помощью фармацевтической композиции по известному способу (Патент RU №2784233, МПК A61K 48/00, A61K 35/12, А61Р 9/10, А61Р 25/02 - 23.11.2022, Бюл. №33). Фармацевтическую композицию, включающую в себя химерные аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1 в равном соотношении каждого вектора, с помощью стерильного шприца вводили через порт в контейнер для крови, содержащий лейкоконцентрат. Соотношение клеток лейкоконцентрата и аденовирусных векторов в составе фармацевтической композиции составило 1:10, или параметр MOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) равнялся 10 (MOI=10). Репортерный ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок GFP, в составе аденовирусного вектора Ad5/F35-GFP, использовали для получения лейкоконцетрата, продуцирующего репортерный зеленый флуоресцирующий (GFP - green fluorescent protein). Трансдукцию лейкоконцентрата проводили при комнатной температуре (21-22°С), при постоянном покачивании на шейкере. Через 12 часов в контейнер добавляли 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 rpm и температуре 10°С в течение 10 минут с помощью центрифуги Presvac. Далее с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 из контейнера экстрагировали надосадочную жидкость, включающую в себя физиологический раствор, фрагменты клеток крови и свободные вирусные частицы, таким образом, чтобы в контейнере осталось приблизительно 30 мл физиологического раствора, содержащего лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом.

Этап II. Превентивная генная терапия: внутривенное введение здоровым мини-свиньям аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, до моделирования инсульта.

Под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно в асептических условиях животным опытной группы (n=3) внутривенно в объеме 30 мл через ушную вену вводили свежеприготовленный аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генами VEGF165, GDNF и NCAM1. Животным контрольной группы (n=3) вводили 30 мл физиологического раствора. Животным репортерной группы (n=2) вводили свежеприготовленный аутологичный лейкоконцетрат, продуцирующий репортерный белок GFP. Репортерную группу использовали для анализа миграции, выживания и способности продукции рекомбинантного белка генетически модифицированными лейкоцитами в головном мозге подопытных животных.

Этап III. Моделирование ишемического инсульта головного мозга у подопытных мини-свиней.

Животным из опытной и репортерной групп через 2 суток после инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, моделировали ишемический инсульт головного мозга. Контрольным животным инсульт моделировали в плановом порядке. Подопытных животных наркотизировали с помощью Zoletil® 100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно и подключали к ингаляционному наркозному аппарату (Minor Vet Optima, Zoomed), по которому подавали изофлуран (Laboratories Karizoo, S.A., Spain) в 2,0-2,5% в смеси с кислородом. После трепанации левой височной кости рассекали твердую мозговую оболочку и под операционным микроскопом путем электрокоагуляции прижигали дистальные ветви средней мозговой артерии. Для уменьшения кровотока в вилизиевом круге дополнительно перевязывали правую сонную артерию. Послеоперационный уход включал в себя анальгезирующую (кеторол 30 мг/мл, 2 р/д, в/м, 10 дней), антибактериальную (цефотаксим в/м, 1 гр/5 мл, 1 р/д, 7 дней) и инфузионную (введение физиологического раствора (0,9% NaCl) 400,0 мл подкожно капельно 1 р/д, 3 дня) терапию.

Этап IV. Оценка способности клеток аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, к миграции в периинфарктую область мозга.

Через неделю после внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного репортерным геном GFP (репортерная группа), в периинфарктной области левого полушария с помощью флуоресцентной микроскопии были обнаружены GFP-позитивные лейкоциты (7,4 [8,5] клеток/мм2). Эти данные свидетельствуют о том, что генетически модифицированные лейкоциты после внутривенной инфузии мигрируют в периинфарктную область и продуцируют рекомбинантные белки, которые по паракринному механизму могут повышать нейропластичность в периинфарктной области и оказывать положительное влияние на сохранность нервной ткани в условиях ишемии.

Этап V. Оценка эффективности превентивной генной терапии ишемического инсульта с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, после моделирования инсульта.

Тест "Открытое поле" использовали для оценки уровня общей локомоторной активности у экспериментальных животных до моделирования инсульта и на 3, 7, 14 и 21 сутки после операции. Мини-свиней помещали в арену (3×3 м), разделенную на 6 квадратов. Горизонтальную активность оценивали путем подсчета количества пересеченных линий за 10 мин. Через 3 суток после моделирования инсульта горизонтальная активность у контрольных и опытных животных значительно снизилась, по отношению с показателями, зарегистрированными у этих животных до операции. Через 7 суток у опытных мини-свиней был установлен рост горизонтальной активности, тогда как у контрольных животных этот показатель продолжал снижаться. Через 14 суток горизонтальная активность у опытных мини-свиней не изменялась, а у контрольных животных происходило ее увеличение. На 21 сутки эксперимента значения у мини-свиней из опытной и контрольной групп не отличались (Фигура 1).

Морфометрический анализ относительного объема инфаркта мозга у подопытных животных через 21 сутки после моделирования ишемического инсульта обнаружил, что объем инфаркта головного мозга у контрольных мини-свиней равнялся 0,322 (0,307-0,328) см3, а у животных из опытной группы он был в 2,4 раза меньше и равнялся 0,134 (0,107-0,142) см3 (Фигура 2). При этом иммунофлуоресцентный анализ коры головного мозга в периинфарктной области обнаружил, что количество клеток, вступивших в апоптоз (каспаза 3-позитивных клеток), в опытной группе (58,00 [56,50-59,00]) было меньше, чем контрольной 65,00 (62,50-69,00).

Полученные нами данные дают основание полагать о положительном терапевтическом эффекте превентивной генной терапии с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, на восстановление двигательной активности и сохранность мозга у мини-свиней после моделирования ишемического инсульта. Положительный эффект внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, может быть обусловлен: во-первых - генетически модифицированные лейкоциты могут проходить через нарушенный гематоэнцефалический барьер и занимать ишемическую область, а секретируемые клетками рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM могут действовать на клетки-мишени по паракринному механизму; а во-вторых -рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM, секретируемые генетически модифицированными лейкоцитами в кровоток, могут диффундировать через поврежденный гематоэнцефалический барьер в ткани мозга и повышать нейропластичность по эндокринному механизму.

Таким образом, приведенный Пример свидетельствует что, аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно композицией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, является эффективным генно-клеточным препаратом для превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга.

Преимущество заявленного способа превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга от известных в мире на дату подачи заявки методов заключается в использовании аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно композицией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, для персонифицированной профилактики инсульта при высоком риске ишемического инсульта у пациентов с транзиторными ишемическими атаками различного происхождения. Композиция рекомбинантных генов включает в себя гены, кодирующие молекулы стимуляторы регенерации в центральной нервной системе. Кроме того, VEGF обладает ангиогенным действием, а экспрессия нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) на поверхности генетически модифицированных лейкоцитов может способствовать их эффективной миграции в область ишемического повреждения мозга и повышать их выживаемость, что обеспечит эффективную локальную (в области ишемической полутени) продукцию рекомбинантных терапевтических молекул генетически модифицированными лейкоцитами.

Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, может быть приготовлен в больничных центрах крови из периферической крови пациента и химерных аденовирусных векторов (Ad5/35), несущих рекомбинантные терапевтические гены. Важно отметить, что процедура приготовления, генетически обогащенного лейкоконцентрата проводится в стандартном контейнере для крови без использования продуктов животного происхождения, антибиотиков и других химических веществ для культивирования клеток in vitro. Продукция рекомбинантных VEGF165, GDNF и NCAM1 генетически модифицированными лейкоцитами начинается в первые сутки после внутривенной инфузии аутологичного генетически обогащенного лейкоконцентрата и продолжается в течение 3 недель, что обусловлено периодом полувыведения генетических конструкций. В этот 3-х недельный период рекомбинантные терапевтические молекулы в случае сосудистой катастрофы увеличат жизнеспособность нейронов мозга и, таким образом, предотвратят массовую гибель нейронов в ишемической полутени в течение 3-6 часового периода терапевтического окна при наступлении инсульта. Ограниченная 3-х недельным периодом экспрессия рекомбинантных генов не исключает повторное безопасное введение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, при сохранении угрозы возникновения инсульта мозга.

Изобретение может быть использовано в специализированных медицинских учреждениях, где пациенту при угрозе инсульта в профилактических целях внутривенно вводят генно-клеточный препарат - аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный искусственным генетическим материалом. Генно-клеточный препарат готовят на основе лейкоцитов периферической крови пациента и композиции репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека. Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно композицией их трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, используют в лечебных целях для повышения нейропластичности мозга и предотвращения массовой гибели нейронов в области ишемической полутени в течение 3-6 часового периода терапевтического окна при наступлении инсульта.

Формула изобретения

Способ персонифицированной превентивной генной терапии при высоком риске наступления ишемического инсульта головного мозга путем внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного тремя терапевтическими генами, кодирующими

сосудистый эндотелиальный фактора роста VEGF165,

глиальный нейротрофический фактор GDNF и

нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM1,

отличающийся тем, что

лечение проводят при угрозе инсульта с целью сдерживания массовой гибели нейронов в области пенумбры в результате воздействия рекомбинантных нейропротекторных факторов VEGF165, GDNF и NCAM1, продуцируемых собственными лейкоцитами, и которые при возникновении инсульта через нарушенный гематоэнцефалический барьер способны проникать из кровотока в область ишемического повреждения с момента наступления инсульта и в период терапевтического окна усиливать жизнеспособность нейронов и, таким образом, повышать сохранность мозга.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает новый способ персонифицированной превентивной генной терапии пациента при высоком риске инсульта путем внутривенной инфузии аутологичиого лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, который готовят на основе лейкоцитов периферической крови пациента и репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа, несущих последовательности гена сосудистого эндотелиалыюго фактора роста VEGF165 человека, гена глиального нейротрофического фактора GDNF человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии NCAM1 человека. 2 ил., 1 пр.


Изобретение относится к области медицины в неврологии, в частности к методу персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга для сдерживания негативных последствий в области ишемического повреждения при наступлении инсульта.

По данным Всемирной организации здравоохранения ишемические церебральные инсульты занимают ведущее место среди причин смертей в мире. В России частота инсульта составляет около 500 случаев на 100 тыс. населения. Причем, до 84-87% случаев пациенты с инсультом умирают или остаются инвалидами и лишь 8-10% случаев заканчиваются восстановлением нарушенных функций мозга в первые 3 недели заболевания. Поэтому, профилактика инсульта является не только медицинской, но и социально-экономической проблемой. Медицинские меры профилактики инсульта направлены на предотвращение факторов риска, которые включают в себя коррекцию заболеваний сердечно-сосудистой системы, обмена веществ, гемостаза и др. Особенно важное значение превентивная терапия инсульта имеет в первые часы после возникновения сосудистой катастрофы для предотвращения массовой гибели нейронов. Вокруг первичного очага ишемического инфаркта с необратимыми патоморфологическими сдвигами формируется периинфарктная область - «ишемическая полутень» или «пенумбра», кровоснабжение в которой существенно ниже нормального уровня. Жизнеспособность нейронов в этой области сохраняется в течение 3-6 часового периода, так называемого «терапевтического окна», во время которого имеется возможность усилить свойства нейропластичности мозга и повысить жизнеспособность нейронов в условиях ишемии. Таким образом, превентивная терапия при угрозе инсульта, может быть эффективным способом предупредить распространение инфаркта на пограничные с первичным очагом некроза области ткани мозга (ишемическую полутень) в период терапевтического окна. При этом превентивной терапии, нацеленной на сдерживание постишемических повреждений мозга при наступлении инсульта, не существует.

В настоящее время в эксперименте для терапии нейродегенеративных заболеваний, нейротравм и инсультов активно разрабатываются геннотерапевтические препараты с нейропротекторным действием или для стимулирования нейрорегенерации. Множество различных генетических конструкций было разработано в зависимости от типа генетического вектора и загруженной в вектор рекомбинантной кДНК, кодирующей терапевтическую молекулу (doi:10.1002/jnr.20968). Члены семейства нейротрофинов (NGF, BDNF, NT-3 и NT-4/5), семейства глиальных нейротрофических факторов (GDNF, ньютурин, артемин, персефин), семейство нейропоэтических цитокинов (CNTF, LIF, IL-6), семейства сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGF-A, фактор роста плаценты (PGF), VEGF-B, VEGF-C и VEGF-D), семейства инсулиноподобных факторов роста (IGF-1, IGF-2) и семейства нейрональных молекул клеточной адгезии (NCAM, L1) широко используют для коррекции заболеваний центральной нервной системы. По способу доставки геннотерапевтического препарата в организм пациента различают прямую генную терапию (in vivo), предполагающую непосредственное введение генетической конструкции, и клеточно-опосредованную генную терапию (ex vivo), при которой для доставки терапевтического гена используют клеточные носители.

Преимущественно работы с применением геннотерапевтических препаратов направлены на лечение инсульта после его возникновения. Целесообразность использования генной терапии при ишемическом инсульте головного мозга доказана в многочисленных доклинических исследованиях в моделях на лабораторных животных [http://dx.doi.org/10.1517/17425247.2016.1144588]. Из исследованного уровня техники известны способы доставки рекомбинантных терапевтических генов с нейропротекторным действием с помощью различных векторных систем путем инъекции геннотерапевтического препарата в цереброспинальную жидкость или непосредственно в ткань мозга до или после моделирования инсульта (doi: 10.3389/fnmol.2016.00034).

Для лечения инсульта в острую фазу известен способ одновременной интратекальной инфузии рекомбинантных генов, кодирующих нейротрофические факторы VEGF, GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, с помощью аденовирусных векторов пятого серотипа (Ad5), или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека (Патент RU №2676701, МПК A61K 31/7088 - 10.01.2019, БИ №1).

В другом исследовании с целью превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга крысы представлен способ интратекальной доставки комбинации рекомбинантных генов, кодирующих нейротрофические факторы VEGF, GDNF и нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM, с помощью аденовирусных векторов пятого серотипа (Ad5), или на клеточных носителях с помощью мононуклеарных клеток крови пуповины человека для повышения жизнеспособности нейронов при угрозе инсульта и, таким образом, сдерживания массовой гибели нервных клеток период «терапевтического окна» в области ишемической полутени в случае наступления инсульта (Патент RU №2748940, МПК A61K 31/7088, A61K 48/00, А61Р 9/10, А61Р 43/00 - 01.06.2021, Бюл. №16). При этом доставка генов с помощью клеточных носителей (клеточно-опосредованная, ex vivo генная терапия) считается более безопасной, при которой отсутствует неуправляемая трансдукция различных клеток тканей и органов, а также прямое токсическое и иммуногенное действие вирусного вектора на организм реципиента, как в случае прямой (in vivo) генной терапии (doi:10.3390/ijms21186858).

Однако в уровне техники приведенных выше примеров для безопасной превентивной генной терапии существует необходимость использования аллогенных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, а введение генно-клеточного препарата осуществляют путем интратекальной инъекции в цереброспинальную жидкость. Недостатком использования мононуклеарных клеток крови пуповины человека в качестве клеточных носителей терапевтических генов являются существенные ограничения для их активного применения в практической медицине, связанные как с недостаточным количеством клеточного материала, который забирается и хранится в криобанках персонально для донора, так и с рисками аллотрансплантации. Интратекальная инъекция в цереброспинальную жидкость лекарственных средств посредством люмбальной пункции - сложная инвазивная манипуляция, которую в условиях стационара выполняет опытный специалист, и для превентивной генной терапии такой способ введения геннотерапевтического препарата не может быть применен для широкого использования.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами, кодирующими VEGF, GDNF и NCAM, для генио-клеточной терапии инсульта головного мозга в острую фазу (Патент RU №2784233, МПК A61K 48/00, A61K 35/12, А61Р 9/10, А61Р 25/02 - 23.11.2022, Бюл. №33). Данный способ предполагает использование собственных лейкоцитов пациента как в качестве носителей генов, кодирующих нейротрофические факторы, так и продуцентов рекомбинантных терапевтических молекул в организме пациента для сдерживания развития ишемического повреждения мозга. Эффективность генетически модифицированного аутологичного лейкоконцентрата доказана в моделях на мини-свиньях с моделью ишемического инсульта головного мозга при внутривенном введении генно-клеточного препарата в период терапевтического окна.

Однако на сегодняшний день способ персонифицированной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга с помощью аутологичных лейкоцитов, продуцирующих рекомбинантные нейропотекторные факторы не известен.

Задачей настоящего изобретения является решение перечисленных проблем, связанных с клеточным носителем терапевтических генов и способа введения генно-клеточного препарата для превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка простого, экономичного и эффективного способа персонифицированной превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга путем внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного терапевтическими генами, при высоком риске наступления инсульта.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что в предложенном способе превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга используют аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный искусственным генетическим материалом, для временной продукции рекомбинантных факторов с нейропротекторным действием, повышающих нейропластичность мозга и способных предупредить массовую гибель нейронов в области пенумбры в период терапевтического окна, при возможном наступлении ишемического инсульта. Для получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного искусственным генетическим материалом - лейкоконцентрат получают из цельной крови пациента и трансдуцируют с помощью фармацевтической композиции, в состав которой входят три репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека. При высоком риске ишемического инсульта из лейкоконцентрата пациента и фармацевтической композиции готовят обогащенный рекомбинантными генами vegf165, gdnf и ncam1 лейкоконцентрат, который вводят путем внутривенной инфузии для сдерживания массовой гибели нейронов в области пенумбры (ишемической полутени) при наступлении инсульта.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:

Фиг. 1 - данные, полученные при анализе поведенческого теста «Открытое поле». Результаты горизонтальной активности у контрольных и опытных мини-свиней представлены в процентном отношении к базовому уровню, принятому за 100%, до моделирования инсульта (Тренировка) и на 3, 7 и 14 и 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Сплошная линия показывает изменения показателей поведенческого теста у контрольных животных, пунктирная линия - у опытных животных.

Фиг. 2 - результаты морфометрического анализа объема (см3) инфаркта головного мозга контрольных и опытных мини-свиней через 21 сутки после окклюзии средней мозговой артерии. Серый прямоугольник соответствует данным контрольных животных, белый - опытных мини-свиней. Поперечные линии внутри прямоугольников - медиана значений, границы прямоугольников - 1-ый и 3-ий квартили, Т-образные линии, выходящие из прямоугольников - минимальные и максимальные наблюдаемые значения.

Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется нижеприведенным примером использования аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного фармацевтической композицией, для превентивной генной терапии ишемического инсульта в модели на мини-свиньях.

Пример получения аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно фармацевтической композицией, содержащей композицию из трех репликативно-дефектных химерных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) человека, и его использования для персонифицированной превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга в моделях на мини-свиньях.

В примере были использованы самки вьетнамских вислобрюхих мини-свиней весом 20-25 кг (n=8). Протоколы анестезии, оперативных вмешательств, послеоперационного ухода и эвтаназии животных одобрены Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинског о университета (№5 от 26 мая 2020 года). Дизайн экспериментов включает в себя следующие этапы:

Этап I. Изготовление аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного рекомбинантными генами, кодирующими VEGF165, GDNF и NCAM1.

У подопытных мини-свиней под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно, в асептических условиях из подключичной вены забирали 50 мл крови в контейнеры для крови (гемакон), содержащие 35 мл антикоагулянта (ЦФДА-1) и процессировали для получения лейкоконцентрата по известному способу (Патент RU №2716013, МПК A61K 48/00, A61K 35/00, опубл. 05.03.2020, Бюл. №7). Далее, полученный лейкоконцентрат, обогащали искусственным генетическим материалом с помощью фармацевтической композиции по известному способу (Патент RU №2784233, МПК A61K 48/00, A61K 35/12, А61Р 9/10, А61Р 25/02 - 23.11.2022, Бюл. №33). Фармацевтическую композицию, включающую в себя химерные аденовирусные векторы Ad5/F35-VEGF165, Ad5/F35-GDNF и Ad5/F35-NCAM1 в равном соотношении каждого вектора, с помощью стерильного шприца вводили через порт в контейнер для крови, содержащий лейкоконцентрат. Соотношение клеток лейкоконцентрата и аденовирусных векторов в составе фармацевтической композиции составило 1:10, или параметр MOI (multiplicity of infection - множественность инфицирования) равнялся 10 (MOI=10). Репортерный ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок GFP, в составе аденовирусного вектора Ad5/F35-GFP, использовали для получения лейкоконцетрата, продуцирующего репортерный зеленый флуоресцирующий (GFP - green fluorescent protein). Трансдукцию лейкоконцентрата проводили при комнатной температуре (21-22°С), при постоянном покачивании на шейкере. Через 12 часов в контейнер добавляли 200 мл стерильного физиологического раствора и центрифугировали при 1000 rpm и температуре 10°С в течение 10 минут с помощью центрифуги Presvac. Далее с помощью фракционатора компонентов крови ФК-01 из контейнера экстрагировали надосадочную жидкость, включающую в себя физиологический раствор, фрагменты клеток крови и свободные вирусные частицы, таким образом, чтобы в контейнере осталось приблизительно 30 мл физиологического раствора, содержащего лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом.

Этап II. Превентивная генная терапия: внутривенное введение здоровым мини-свиньям аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, до моделирования инсульта.

Под анестезией с помощью Zoletil®100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно в асептических условиях животным опытной группы (n=3) внутривенно в объеме 30 мл через ушную вену вводили свежеприготовленный аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генами VEGF165, GDNF и NCAM1. Животным контрольной группы (n=3) вводили 30 мл физиологического раствора. Животным репортерной группы (n=2) вводили свежеприготовленный аутологичный лейкоконцетрат, продуцирующий репортерный белок GFP. Репортерную группу использовали для анализа миграции, выживания и способности продукции рекомбинантного белка генетически модифицированными лейкоцитами в головном мозге подопытных животных.

Этап III. Моделирование ишемического инсульта головного мозга у подопытных мини-свиней.

Животным из опытной и репортерной групп через 2 суток после инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, моделировали ишемический инсульт головного мозга. Контрольным животным инсульт моделировали в плановом порядке. Подопытных животных наркотизировали с помощью Zoletil® 100 (Virbac Sante Animale, France), 3 мг/кг внутримышечно и подключали к ингаляционному наркозному аппарату (Minor Vet Optima, Zoomed), по которому подавали изофлуран (Laboratories Karizoo, S.A., Spain) в 2,0-2,5% в смеси с кислородом. После трепанации левой височной кости рассекали твердую мозговую оболочку и под операционным микроскопом путем электрокоагуляции прижигали дистальные ветви средней мозговой артерии. Для уменьшения кровотока в вилизиевом круге дополнительно перевязывали правую сонную артерию. Послеоперационный уход включал в себя анальгезирующую (кеторол 30 мг/мл, 2 р/д, в/м, 10 дней), антибактериальную (цефотаксим в/м, 1 гр/5 мл, 1 р/д, 7 дней) и инфузионную (введение физиологического раствора (0,9% NaCl) 400,0 мл подкожно капельно 1 р/д, 3 дня) терапию.

Этап IV. Оценка способности клеток аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, к миграции в периинфарктую область мозга.

Через неделю после внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного репортерным геном GFP (репортерная группа), в периинфарктной области левого полушария с помощью флуоресцентной микроскопии были обнаружены GFP-позитивные лейкоциты (7,4 [8,5] клеток/мм2). Эти данные свидетельствуют о том, что генетически модифицированные лейкоциты после внутривенной инфузии мигрируют в периинфарктную область и продуцируют рекомбинантные белки, которые по паракринному механизму могут повышать нейропластичность в периинфарктной области и оказывать положительное влияние на сохранность нервной ткани в условиях ишемии.

Этап V. Оценка эффективности превентивной генной терапии ишемического инсульта с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, после моделирования инсульта.

Тест "Открытое поле" использовали для оценки уровня общей локомоторной активности у экспериментальных животных до моделирования инсульта и на 3, 7, 14 и 21 сутки после операции. Мини-свиней помещали в арену (3×3 м), разделенную на 6 квадратов. Горизонтальную активность оценивали путем подсчета количества пересеченных линий за 10 мин. Через 3 суток после моделирования инсульта горизонтальная активность у контрольных и опытных животных значительно снизилась, по отношению с показателями, зарегистрированными у этих животных до операции. Через 7 суток у опытных мини-свиней был установлен рост горизонтальной активности, тогда как у контрольных животных этот показатель продолжал снижаться. Через 14 суток горизонтальная активность у опытных мини-свиней не изменялась, а у контрольных животных происходило ее увеличение. На 21 сутки эксперимента значения у мини-свиней из опытной и контрольной групп не отличались (Фигура 1).

Морфометрический анализ относительного объема инфаркта мозга у подопытных животных через 21 сутки после моделирования ишемического инсульта обнаружил, что объем инфаркта головного мозга у контрольных мини-свиней равнялся 0,322 (0,307-0,328) см3, а у животных из опытной группы он был в 2,4 раза меньше и равнялся 0,134 (0,107-0,142) см3 (Фигура 2). При этом иммунофлуоресцентный анализ коры головного мозга в периинфарктной области обнаружил, что количество клеток, вступивших в апоптоз (каспаза 3-позитивных клеток), в опытной группе (58,00 [56,50-59,00]) было меньше, чем контрольной 65,00 (62,50-69,00).

Полученные нами данные дают основание полагать о положительном терапевтическом эффекте превентивной генной терапии с помощью аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, на восстановление двигательной активности и сохранность мозга у мини-свиней после моделирования ишемического инсульта. Положительный эффект внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генами VEGF165, GDNF и NCAM1, может быть обусловлен: во-первых - генетически модифицированные лейкоциты могут проходить через нарушенный гематоэнцефалический барьер и занимать ишемическую область, а секретируемые клетками рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM могут действовать на клетки-мишени по паракринному механизму; а во-вторых -рекомбинантные VEGF, GDNF и NCAM, секретируемые генетически модифицированными лейкоцитами в кровоток, могут диффундировать через поврежденный гематоэнцефалический барьер в ткани мозга и повышать нейропластичность по эндокринному механизму.

Таким образом, приведенный Пример свидетельствует что, аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно композицией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, является эффективным генно-клеточным препаратом для превентивной генной терапии при угрозе ишемического инсульта головного мозга.

Преимущество заявленного способа превентивной генной терапии ишемического инсульта головного мозга от известных в мире на дату подачи заявки методов заключается в использовании аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, а именно композицией из трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, для персонифицированной профилактики инсульта при высоком риске ишемического инсульта у пациентов с транзиторными ишемическими атаками различного происхождения. Композиция рекомбинантных генов включает в себя гены, кодирующие молекулы стимуляторы регенерации в центральной нервной системе. Кроме того, VEGF обладает ангиогенным действием, а экспрессия нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) на поверхности генетически модифицированных лейкоцитов может способствовать их эффективной миграции в область ишемического повреждения мозга и повышать их выживаемость, что обеспечит эффективную локальную (в области ишемической полутени) продукцию рекомбинантных терапевтических молекул генетически модифицированными лейкоцитами.

Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, может быть приготовлен в больничных центрах крови из периферической крови пациента и химерных аденовирусных векторов (Ad5/35), несущих рекомбинантные терапевтические гены. Важно отметить, что процедура приготовления, генетически обогащенного лейкоконцентрата проводится в стандартном контейнере для крови без использования продуктов животного происхождения, антибиотиков и других химических веществ для культивирования клеток in vitro. Продукция рекомбинантных VEGF165, GDNF и NCAM1 генетически модифицированными лейкоцитами начинается в первые сутки после внутривенной инфузии аутологичного генетически обогащенного лейкоконцентрата и продолжается в течение 3 недель, что обусловлено периодом полувыведения генетических конструкций. В этот 3-х недельный период рекомбинантные терапевтические молекулы в случае сосудистой катастрофы увеличат жизнеспособность нейронов мозга и, таким образом, предотвратят массовую гибель нейронов в ишемической полутени в течение 3-6 часового периода терапевтического окна при наступлении инсульта. Ограниченная 3-х недельным периодом экспрессия рекомбинантных генов не исключает повторное безопасное введение аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного генетическим материалом, при сохранении угрозы возникновения инсульта мозга.

Изобретение может быть использовано в специализированных медицинских учреждениях, где пациенту при угрозе инсульта в профилактических целях внутривенно вводят генно-клеточный препарат - аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный искусственным генетическим материалом. Генно-клеточный препарат готовят на основе лейкоцитов периферической крови пациента и композиции репликативно-дефектных аденовирусных векторов 5 серотипа с фибером 35 серотипа (Ad5/F35), несущих последовательности гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165, англ. Vascular Endothelial Growth Factor) человека, гена глиального нейротрофического фактора (GDNF, англ. Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor) человека и гена нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1, англ. Neural Cell Adhesion Molecule) человека. Аутологичный лейкоконцентрат, обогащенный генетическим материалом, а именно композицией их трех генов, кодирующих VEGF165, GDNF и NCAM1, используют в лечебных целях для повышения нейропластичности мозга и предотвращения массовой гибели нейронов в области ишемической полутени в течение 3-6 часового периода терапевтического окна при наступлении инсульта.

Формула изобретения

Способ персонифицированной превентивной генной терапии при высоком риске наступления ишемического инсульта головного мозга путем внутривенной инфузии аутологичного лейкоконцентрата, обогащенного тремя терапевтическими генами, кодирующими

сосудистый эндотелиальный фактора роста VEGF165,

глиальный нейротрофический фактор GDNF и

нейрональную молекулу клеточной адгезии NCAM1,

отличающийся тем, что

лечение проводят при угрозе инсульта с целью сдерживания массовой гибели нейронов в области пенумбры в результате воздействия рекомбинантных нейропротекторных факторов VEGF165, GDNF и NCAM1, продуцируемых собственными лейкоцитами, и которые при возникновении инсульта через нарушенный гематоэнцефалический барьер способны проникать из кровотока в область ишемического повреждения с момента наступления инсульта и в период терапевтического окна усиливать жизнеспособность нейронов и, таким образом, повышать сохранность мозга.

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)
Биотехнология
Рустем
Исламов
Робертович
Заведующий кафедрой
Доктор медицинских наук
Профессор
-
-
РОССИЯ
Алексей
Созинов
Станиславович
Ректор
РОССИЯ
62.13.27
Оптимизация биотехнологических процессов
03.03.WV
SOCIAL SCIENCES, BIOMEDICAL
Рустем
Исламов
Робертович
РОССИЯ
ФГБОУ ВО КАЗАНСКИЙ ГМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1021602848189
АЛЕКСЕЙ
СОЗИНОВ
СТАНИСЛАВОВИЧ
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения