Способ моделирования дисфункции эндотелия в патологии внутренних органов в эксперименте
дисфункция эндотелия интоксикационный синдром L-NAME никель NO-синтаза оксид азота
Изобретение относится к медико-биологической, патофизиологической науке и касается моделирования дисфункции эндотелия и патологии внутренних органов при экспериментальном интоксикационном синдроме в сочетании с L-NAME. Для этого воспроизводят метаболические нарушения посредством введения экспериментальным животным парентеральной экспозиции хлорида никеля в дозе 0,5 мг/кг от веса животного один раз в сутки в течение 30 дней, а также в комбинации с хлоридом никеля дополнительно вводят парентерально ингибитор фермента - эндотелиальной NO-синтазы, продуцирующий оксид азота, - L-NAME в дозе 25 мг/кг от веса животного один раз в сутки в течение 30 дней. Изобретение обеспечивает повышение точности и адекватности исследования патогенетических механизмов формирования дисфункции эндотелия и характера изменений метаболических показателей в крови и внутренних органах, а также повышение эффективности, воспроизводимости, удобства, доступности, безопасности и невысокую стоимость экспериментов. 3 ил., 2 табл., 1 пр.


Способ моделирования дисфункции эндотелия и патологии внутренних органов в эксперименте

Изобретение относится к медико-биологической, патофизиологической науке и касается моделирования дисфункции эндотелия и патологии внутренних органов при экспериментальном интоксикационном синдроме в сочетании с L-NAME.

Известен способ моделирования дисфункции эндотелия in vitro, включающий одновременную инкубацию культуры эндотелиальных клеток, (см. патент RU №2490632, МПК2006.01 G01N 33/48, опубл. 20.08.2013 г.)

Недостатком аналога является то, что результаты исследований, проведенные in vitro, не согласовываются с данными, полученными in vivo, а также результаты исследований не внедрены в клинику.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ моделирования дисфункции эндотелия и патологии внутренних органов в эксперименте, включающий воспроизведение метаболических нарушений посредством парентеральной экспозиции экспериментальным животным хлорида никеля в дозе 0,5 мг/кг от веса животного один раз в сутки в течение 30 дней, (см. статью Дзугкоева С.Г., Можаева И.В., Маргиева О.И. и др. "Влияние L-аргинина и его комбинации с L-карнитином на метаболические показатели дисфункции эндотелия в условиях интоксикации никеля хлоридом". Астраханский медицинский журнал, т. 12, №1, 2017 г., с. 44-49).

Недостатками прототипа является низкая точность и адекватность исследования патогенетических механизмов формирования дисфункции эндотелия и характера изменений метаболических показателей в крови и внутренних органах - почках, печени, миокарде и отсутствие исследования уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3). Все исследования были проведены в сочетании с L-карнитином и L-аргинином как способ, направленный на достижение коррекции дисфункции эндотелия, а не на его моделирование.

Техническим результатом предлагаемого технического решения является повышение точности и адекватности исследования патогенетических механизмов формирования дисфункции эндотелия и характера изменений метаболических показателей в крови и внутренних органах - почках, печени, миокарде, уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), а также повышение эффективности, воспроизводимости, удобства, доступности, безопасности и снижение стоимости экспериментов.

Решение технического результата заключается в том, что в способе моделирования дисфункции эндотелия и патологии внутренних органов в эксперименте, включающим воспроизведение метаболических нарушений посредством введения экспериментальным животным парентеральной экспозиции хлорида никеля в дозе 0,5 мг/кг от веса животного один раз в сутки в течение 30 дней, согласно изобретению, в комбинации с хлоридом никеля дополнительно вводят экспериментальным животным парентерально ингибитор фермента - эндотелиальной NO-синтазы, продуцирующий оксид азота - L-NAME, в дозе 25 мг/кг от веса животного один раз в сутки в течение 30 дней.

Данный способ позволит повысить точность и адекватность исследования патогенетических механизмов формирования дисфункции эндотелия и характера изменений метаболических показателей в крови и внутренних органах - почках, печени, миокарде, уровень экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), а также повысить эффективность, воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и снизить стоимость экспериментов.

Сущность способа поясняется таблицами, где в таблице 1-представлено изменение системы ПОЛ-АОС на фоне комбинации ингибитора фермента эндотелиальной NO-синтазы - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) с хлоридом никеля, а также в группах сравнения, в таблице 2 - изменение концентрации общего холестерина и его содержание в липопротеинах различной плотности на фоне модельного эксперимента, а также чертежами, где на фиг. 1 - изображено изменение содержания оксида азота под влиянием L-NAME + хлорид никеля, на фиг. 2 - изображена экспрессия эндотелиальной NO-синтазы в эндотелии аорты на фоне модельного эксперимента у крыс, на фиг. 3 - динамика изменения гистологических показателей в модельном эксперименте на фоне ингибитора фермента эндотелиальной NO-синтазы - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и его сочетания с хлоридом никеля.

Моделирование эндотелиальной дисфункции в эксперименте путем внутримышечного введения хлорида никеля в комбинации с ингибитором L-NAME, который вводят внутрибрюшинно в течение 30 дней вызывает нарушение окислительно-восстановительного потенциала организма, индуцирующее процессы ПОЛ в эритроцитах и происходит повышение концентрации МДА в гемолизате эритроцитов, в почечной, печеночной и миокардиальной тканях. Анализ активности ферментов антиокислительной системы (АОС) показал статистически достоверное снижение функциональной способности СОД в эритроцитах, повышение каталазы и концентрации ЦП в сыворотке крови. Разнонаправленный характер изменений адаптивных ферментов, скорее всего, объясняется их различной молекулярной структурой. Таким образом, никелевая интоксикация с ингибитором экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3 - фермент, продуцирующий оксид азота) в условиях нарушения окислительно-восстановительного потенциала сопровождалась снижением концентрации NOx - основного биохимического маркера дисфункции эндотелия. Данная модель характеризовалась нарушением обмена холестерина, гиперхолестеринемией и гипер-β-липопротеинемией, что способствовало повреждению эндотелия. Полученные результаты были подтверждены гистологическими данными аорты, почечной, печеночной и миокардиальной тканей. На срезах тканей внутренних органов интоксифицированных крыс в сочетании с L-NAME отмечались умеренная гиалиново - капельная дистрофия канальцев и расширение мочевых пространств; умеренная паренхиматозно-белковая дистрофия и частичное исчезновение гликогена в гепатоцитах; частичная фрагментация кардиомиоцитов; отмечалась плазматическая пропитка и умеренное утолщение сосудов микроциркуляторного русла. Нарушение метаболических процессов характеризовались снижением активности Na, K-АТФ-азы и повышением в крови специфических для органов ферментов - трансаминаз, ГГТП, щелочной фосфатазы.

Способ осуществляли следующим образом.

Моделировали дисфункцию эндотелия на линейных («Wistar») крысах, контрольных и интоксифицированных с L-NAME, который вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг, а хлорид никеля, в дозе 0,5 мг/кг веса крысы вводили внутримышечно 30 дней. Проведение экспериментов соответствовали международным принципам гуманного отношения к животным («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», Хельсинкская декларация). Эксперимент по выявлению метаболических нарушений, характеризующие дисфункцию эндотелия длился 30 дней. По окончании эксперимента забирали кровь из сердца, в отмытых эритроцитах определяли содержание МДА, СОД, а в сыворотке крови - активность каталазы и концентрацию ЦП и суммарных метаболитов NOx. В отдельном эксперименте определяли экспрессию эндотелиальной NO-синтазы в эндотелии аорты. Для выяснения причин нарушенной биодоступности NO определяли метаболизм холестерина. Проводили гистологические исследования. По окончанию эксперимента исследовалась интенсивность перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов, почечной, печеночной и миокардиальной тканях по вторичному продукту - альдегиду малоновой кислоты (МДА). Об активности антиокислительной защиты клеток (АОЗ) в крови судили по активности каталазы, концентрации церулоплазмина (ЦП), а супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах. Обмен ХС оценивали по концентрации общего ХС, его содержанию в липопротеинах низкой (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП) и ТАГ. Определяли концентрацию суммарных метаболитов оксида азота (NOx) в реакции деазотирования, согласно модифицированному экспресс-методу Метельской В.А. О мембранных механизмах повреждения клеток органов судили по активности в клетках почечной, печеночной тканей и миокарде, АТФ-азы, активируемой Na и К, а также по активности в сыворотке крови - специфичных для органов энзимов: АлАТ, AcAT, ГГТП и щелочной фосфатазы.

В отдельном варианте исследовали уровень экспрессии eNOS в эндотелии аорты. Уровень экспрессии eNOS в эндотелии аорты определяли методом Метельской В.А., Тумановой Н.Г., Литинской О.А. (Оксид азота: роль в регуляции биологических функций, методы определения в крови человека // Лабораторная медицина. - 2005. - №7. - С. 19-24). Аорты извлекали, промывали физиологическим раствором и помещали в пластиковые пробирки, которые хранили в жидком азоте, после чего аорты обрабатывали соответственно методике. Полосу, соответствующую эндотелиальной NO-синтазе, детектировали в соответствии с ее молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Пленку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы X к интенсивности полосы, принятой за контроль на каждой пленке. Аорта экспериментальных крыс подвергалась гистологическому исследованию микроскопически. Количественную оценку гистологических изменений структуры проводили по методу Автандилова с помощью цифрового фотоаппарата "Nikon", совмещенного с микроскопом. Исследование проводили в 4-х группах крыс-самцов линии Вистар:

- Контролем служили:

интактные крысы в количестве 20 голов (1 группа);

- Опытная группа:

Крысы с хлоридом никеля + L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов (2 группа);

- Группы сравнения:

Интактные крысы + L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 15 голов (3группа);

Крысы с хлоридом никеля в количестве 30 голов (4 группа).

Модель дисфункции эндотелия вызывали введением 0,5 мг/кг веса животного хлорида никеля в комбинации с L-NAME в дозе 25 мг/кг.

Сущность заявляемого способа подтверждена графически и таблицами: При статистической обработке данных рассчитывали среднее значение, величину стандартного отклонения. Различия считали достоверными при р<0,05.

Пример конкретного выполнения способа.

Результаты показали существенное повышение концентрации МДА в крови под влиянием хлорида никеля и L-NAME (с 4,41±0,08 нмоль/мл до 6,25±0,044 нмоль/мл (р<0,001). Данные анализа активности АОС выявили достоверное снижение активности СОД в эритроцитах (с 88,8±1,77 ед.акт. до 47,8±2,23 ед.акт. (р<0,001) и повышение данных каталазы и церулоплазмина. Несоответствие данных каталазы и ЦП является следствием повышенного образования Н2О2 и вследствие этого активации защитных механизмов (см. табл. 1).

Причиной сниженного образования NO явилось его взаимодействие с O2- и образования сильного окислителя пероксинитрита, а также снижение уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы модифицированным L-аргинином - L-NAME. Ингибируется поток электронов между редуктазным и оксидазным доменами фермента. Такая молекулярная перестройка энзима оптимальна для продукции АФК, что и усугубляет выраженность окислительного стресса. Эти изменения способствовали снижению концентрации суммарных метаболитов NOx и корреляционный анализ показал наличие отрицательной связи с МДА (r=-0,74). (см. фиг. 1)

С другой стороны снижается доступность индуктора фермента L-аргинина, вследствие изменений в эндотелии сосудов. Анализ данных показал повышение концентрации общего холестерина (ОХС), ХС ЛПНП, снижение ХС ЛПВП и одновременное повышение ТАГ (см. табл. 2).

Для подтверждения участия эндотелиальной NO-синтазы исследовали уровень экспрессии NO продуцирующего фермента в экстрактах эндотелия аорты у экспериментальных крыс. Что касается самого NO-продуцирующего фермента, данные показали снижение уровня экспрессия эндотелиальной NO-синтазы на фоне L-NAME (см. фиг. 2).

Захват холестерина моноцитами приводит к его накоплению, образованию пенистых клеток с липидным содержимым, липидных пятен и полос, т.е. предатерогенным изменениям, что подтверждается гистологически (см. фиг. 3).

Развившаяся дисфункция эндотелия вызвала повреждение внутренних органов, в них интенсифицировался процесс ПОЛ и содержание конечных продуктов ПОЛ увеличилось в корковом и мозговом веществе соответственно на 153,8% и 91,2%, в печеночной и сердечной тканях на 79% и 70,8%. (см. табл. 1).

Преобладание окислительных процессов привело к нарушению гидрофобности цитоплазматических мембран, снижению активности Na, K-АТФ-азы в клетках внутренних органов и повышению активности в сыворотке крови АлАТ и АсАТ, ГГТП и экскреторного-щелочной фосфатазы.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволит повысить точность и адекватность исследования патогенетических механизмов формирования дисфункции эндотелия и характера изменений метаболических показателей в крови и внутренних органах - почках, печени, миокарде, уровень экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), а также повысить эффективность, воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и снизить стоимость экспериментов.
Клиническая медицина
Вадим
Брин
Борисович
зав. отделом
Доктор медицинских наук
Профессор
-
7003877033
202178
https://elibrary.ru/author_profile.asp?id=202178
0000-0001-8382-3210
РОССИЯ
Алексей
Чибиров
Людвигович
Директор
РОССИЯ
76.03.53
Патологическая физиология
03.01.UM
PHYSIOLOGY
Сергей
Дзгкоев
Гаврилович
Исполнитель
РОССИЯ
Фира
Дзугкоева
Соломоновна
Исполнитель
РОССИЯ
Ольга
Маргиева
Ивановна
Исполнитель
РОССИЯ
Ирина
Можаева
Викторовна
Исполнитель
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ВНЦ РАН
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР "ВЛАДИКАВКАЗСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК"
1021500511878
АЛЕКСЕЙ
ЧИБИРОВ
ЛЮДВИГОВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения