Рекомбинантная плазмидная ДНК pET40CmAP/mutCGL, кодирующая гибридный мутантный бифункциональный полипептид CmAP/mutCGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia amphilecti (СmАР) и мутантного сиалоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus (mutCGL),   рекомбинантный штамм E. coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/mutCGL – продуцент гибридного мутантного бифункционального полипептида CmAP/mutCGL    и  способ его получения
рекомбинантные ДНК-технологии белковая химия рекомбинантная плазмидная ДНК гибридный мутантный бифункциональный полипептид морская бактерия мутантный сиалоспецифичный лектин мидии рекомбинантный штамм продуцент гибридного мутантного  бифункционального полипептида способ получения
Группа изобретений относится к молекулярной биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом по оптимизированной технологии новый гибридный мутантный бифункциональный полипептид CmAP/mutCGL с ферментативными свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP из морской бактерии C. amphilecti и природного лектина CGL из морской мидии C. Grayanus с введенными мутациями H37А, H85А и H129А (mutCGL) в трех сайтах связывания активного центра для смещения Gal/NGal-связывающей специфичности природного лектина CGL в сторону специфичности к сиаловым кислотам у мутантного лектина mutCGL, что может быть использовано для выявления высокосиалированных гликопротеинов муцинового типа.
I.	Плазмида pET40CmAP/mutCGL размером 8227 пар оснований (п.о.), в которой фрагмент ДНК размером 2037 пар оснований, представляющий собой химерный ген, кодирующий структурные гены щелочной фосфатазы CmAP (N-конец гибридной молекулы) и мутантного сиалоспецифичного лектина mutCGL (С-конец гибридной молекулы), соединенные между собой полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность линкера (G4S)3 и сайт энтерокиназы D4K, встроен по сайтам NcoI/SalI в исходную плазмиду pET-40b(+).
II.	Рекомбинантный штамм E. coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/mutCGL получен трансформацией клеток E. coli Rosetta(DE3) плазмидой pET40CmAP/mutCGL с использованием традиционной генно-инженерной технологии [33].
III.	Способ получения гибридного мутантного бифункционального полипептида CmAP/mutCGL заключается в культивировании клеток штамма E. coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/mutCGL в жидкой питательной среде LB в течение 12 часов при 16 °С,.  Затем бактериальные клетки осаждают центрифугированием, суспензию клеток дезинтегрируют в буфере, далее экстракт центрифугируют, после чего надосадочную жидкость помещают на колонку с ионообменной смолой.   Затем элюируют белок и  белковый элюат помещают на колонку с металлоаффинной смолой, после чего активные фракции концентрируют на ионообменной смоле и выделяют целевой продукт гель-фильтрацией.
Технический результат – получение активного гибридного мутантного бифункционального полипептида CmAP/mutCGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и мутантного сиалоспецифичного лектина mutCGL с высоким выходом и уровнем очистки.
Выявление высокосиалированных гликопротеинов муцинового типа
Александра
Сейткалиева
Валерьевна
Заведующая лабораторией
Кандидат биологических наук
Отсутствует
E-7459-2019
55968402200
0000-0002-3431-8055
РОССИЯ
Светлана
Гончарова
Николаевна
Директор департамента сопровождения научной деятельности
РОССИЯ
34.15.17
Макромолекулярные ассоциации и проблемы узнавания в молекулярной биологии
34.15.27
Генетическая инженерия
34.57.21
Материалы для биомедицинского применения
01.06.CQ
BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGY
Лариса
Балабанова
Анатольевна
РОССИЯ
Александра
Сейткалиева
Валерьевна
РОССИЯ
Нина
Буйновская
Сергеевна
РОССИЯ
Людмила
Текутьева
Александровна
РОССИЯ
Оксана
Сон
Михайловна
РОССИЯ
Галина
Лихацкая
Николаевна
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Петр
Мордовской
Григорьевич
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГАОУ ВО "ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ", ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ, ФГАОУ ВО ДВФУ, ДВФУ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"
1022501297785
НИКИТА
АНИСИМОВ
ЮРЬЕВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные автономные учреждения