Способ получения моноклонального пероксидазного конъюгата для идентификации типичных и атипичных штаммов Vibrio cholerae O1, включая и R-варианты в дот-ИФА
VIBRIO CHOLERAE ХОЛЕРА МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПЕРОКСИДАЗНЫЙ КОНЪЮГАТ ПЕРОКСИДАЗА ХРЕНА ДОТ-ИФА
Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии. Сущность способа заключается в том, что в качестве диагностического реагента используют моноклональный пероксидазный конъюгат. Способ включает следующие технологические приемы: активацию пероксидазы, конъюгацию активированной пероксидазы с специфическими иммуноглобулинами, очистку несвязавшихся белков, хранение и контроль. Отличие изобретения состоит в том, что активирование проводят в следующей последовательности: фермент пероксидазу хрена растворяют в 0,3 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 из расчета 5 мг в 1 мл. Через определенные промежутки времени - 1 ч, 30 мин, 1 ч добавляют соответственно 100 мкл 1% 2,4-динитро1-флуор-бензола, 1,0 мл 0,08 М периодата натрия, 1,0 мл 0,16 М этиленгликоля, затем смесь реагентов инкубируют 3 ч в темноте в условиях комнатной температуры при постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин. После этого для конъюгации активированный раствор пероксидазы соединяют с моноклональными антителами, растворенными в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 в соотношении 1:3, а именно: 5 мг пероксидазы и 15 мг МКА, смесь доводят до рН 9,5 путем прибавления 10 мкл 0,5 М карбонат-бикарбонатного буфера. Конъюгацию продолжают в течение 3 ч в темноте при комнатной температуре на магнитной мешалке со скоростью 80-100 об/мин, периодически контролируя показатель рН, чтобы он оставался на уровне 9,5. После реакцию останавливают спустя 3 ч путем внесения 5 мг сухого бромида натрия и оставляют на ночь при температуре 4°С. Очистку конъюгата от несвязавшихся компонентов осуществляют путем диализа в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 при температуре 4°С, проводя замену буфера в течение суток. Окончательную очистку конъюгата проводят при помощи гель-фильтрации на сефадексе G-50, получая конъюгат с титром 1:64-1:128. Изобретение может быть использовано с целью идентификации штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы и R-вариантов, выделяемых в процессе мониторинговых исследований холеры на территории РФ.
Изобретение может быть использовано с целью идентификации штаммов холерных вибрионов O1 серогруппы и R-вариантов, выделяемых в процессе мониторинговых исследований холеры на территории РФ.
Сергей
Водопьянов
Олегович
Главный научный сотрудник
Доктор медицинских наук
Отсутствует
-
6701686549
289536
https://orcid.org/0000-0003-4336-0439
0000-0003-4336-0439
РОССИЯ
Алексей
Носков
Кимович
Директор
РОССИЯ
34.27.05
Методы и аппаратура в микробиологии
34.27.15
Систематика и номенклатура микроорганизмов
01.06.QU
MICROBIOLOGY
Людмила
Алексеева
Павловна
РОССИЯ
Вероника
Евдокимова
Вячеславовна
РОССИЯ
Ольга
Якушева
Александровна
РОССИЯ
Владимир
Кругликов
Дмитриевич
РОССИЯ
Дарья
Левченко
Александровна
РОССИЯ
Роспотребнадзор
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
1047796261512
Организация
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Федеральные государственные казенные учреждения
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
1026103278959
Организация
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Федеральные государственные бюджетные учреждения