Способ определения генотипов бета-казеина крупного рогатого скота путем проведения ПЦР в реальном времени с использованием универсального красителя
генотипирование бета-казеин способ определения ПЦР реальное время
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена бета-казеина (CSN2) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования. Изобретение позволяет упростить способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 бета-казеина, сократить время проведения анализа и значительно удешевить анализ за счёт отказа от использования аллель-специфичных флуоресцентно-меченных зондов и заменой их на интеркалирующий универсальный краситель SYBR-GREEN. Коровье молоко содержит шесть основных белков: четыре казеина (альфа-s1, альфа-s2, бета (β) и каппа) и два сывороточных белка. Среди видов казеина вторым по распространенности является бета-казеин, который имеет, как минимум, 13 различных генетических вариантов. Варианты А1 и А2 CSN2 являются наиболее распространенными среди молочных пород. Ген бета-казеина CSN2 (NSBI ID 281099) расположен в геноме крупного рогатого скота в позиции 6q31 и содержит 8 экзонов. Аллельный вариант бета-казеина A2 является исходной формой [3] и встречается у зебу и исторически более старых пород крупного рогатого скота. Аллельный вариант бета-казеина A1 обнаружили сравнительно недавно. Он чаще встречается в современных породах крупного рогатого скота, По данным исследований диетологов, бета-казеин А1 не полностью расщепляется в желудочно-кишечном тракте и оказывает негативное воздействие на организм человека, в то время как вариант А2 является более безопасным. Во время переваривания в организме бета-казеина А1 высвобождается короткий белок бета-казоморфин-7 (Beta-casomorphin-7 или BCM-7), который является опиоидным пептидом. Предполагают, что именно бета-казоморфин-7 является причиной проблем с молоком А1. На Западе продвижением молока А2 занимается компания «A2 Milk Company». Холмогорская порода - одна из лучших и старейших пород, выведенных в нашей стране. Она не имеет конкурентов по производству молока в суровых климатических условиях северных регионов России [7]. По численности поголовья на начало 2023 г. холмогорский скот занимает третье место, после черно-пестрой и голштинской пород. Удельный вес животных указанного происхождения составляет 5,16 % в общем поголовье крупного рогатого скота молочных пород в Российской Федерации. Основными зонами разведения популяции 135,1 тыс. гол племенного холмогорского скота, в т.ч. 80,0 тыс. коров, являются Архангельская и Вологодская области, Республики Коми и Татарстан. Среди 16 основных молочных пород КРС России холмогорская порода по уровню молочной продуктивности коров (7137-3,88-3,17) занимает 4 ранговую позицию после голштинской (9334-3,87-3,29), айрширской (7580-4,12-3,33), чёрно-пёстрой (7558-3,89-3,20) пород. Для практической селекции крупного рогатого скота на желательный вариант А2 бета-казеина гена CSN2 для целей молочной промышленности необходимо знание существующего соотношения аллельных вариантов А1/А2 бета-казеина в породах скота отечественной селекции и возможность исполнения быстрого и дешёвого анализа на больших массивах животных на популяционном уровне. Несмотря на наличие достоверных данных о взаимосвязи варианта А2 бета-казеина с пищевой безопасностью молочной продукции, на сегодняшний день нет относительно простого в исполнении, быстрого, и главное, дешёвого и массово применимого на больших массивах животных метода генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-казеина CSN2. Для дифференциации аллельных вариантов генов используются методы ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) [9, 10], аллель-специфичный вариант метода ПЦР (АС-ПЦР) [11] и ПЦР в реальном времени с использованием олигонуклеотидов, меченых флуоресцентными зондами. Основными недостатками первых двух методов являются многостадийность анализа (амплификация полиморфного участка гена, рестрикция полученного ампликона специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов), его длительность (8-16 часов), вероятность недостоверных результатов в случае неоптимального соотношения количества ДНК, рестриктазы и времени рестрикции. ПЦР в реальном времени с использованием олигонуклеотидов, меченых флуоресцентными зондами, отличается дороговизной и высокой специфичностью применения. То есть зонды, меченные флуорофором, подходят только для одного вида исследования. Наиболее близким по достигаемому техническому результату, или прототипом, можно считать метод  ПЦР в реальном времени, описанный I. Manga et al . (I. Manga , J. Dvořák / TaqMan allelic discrimination assay for A1 and A2 alleles of the bovine CSN2 gene // Czech J. Anim. Sci., 55, 2010 (8): 307–312.). Указанный метод определения аллельных вариантов гена бета-казеина осуществляется путём применения ПЦР в реальном времени с использованием олигонуклеотидов, меченых специфическими флуоресцентными зондами. Для амплификации продукта длиной 101 п.н., включающего SNP rs43703011 (геномная ДНК: X14711 (http://www.ncbi.nih.gov ) были сконструированы два праймера  для определения аллельных вариантов гена бета-казеина. Для проведения ПЦР в реальном времени были использованы праймеры со следующей нуклеотидной последовательностью: прямой праймер, 5´-CTTTGCCCAGACACAGTCTCTA GT-3´; обратный праймер, 5´-GCACCACCACAGGGG TT-3´). Для генотипирования были использованы два флуоресцентных TaqMan зонда с различными флуоресцентными красителями, что позволяет проводить ПЦР в одной пробирке для аллелей А1 и А2 одновременно. Первый зонд был нацелен на аллель A2 дикого типа (5´-YAK TGGACCCATCCCTAACAGCCTCCC-BBQ-3´), а второй на мутированный аллель A1 (5´-FAM-CTGGACCCATCCATAACAGCCTCCCA BBQ-3´) гена CSN2.  BBQ гаситель был связан с  3´ концом обоих зондов. ПЦР в реальном времени проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл с использованием 10 мкл универсального TaqMan ПЦР мастер -микса, содержащего ДНК AmpliTaq Gold полимеразу, 300 нМ прямого и обратного праймера, 200 нМ каждого зонда, 0,2 мкл  урацил-N-гликозилазы (UNG) и 1 мкл (50-100нг) образца ДНК. ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе 7500 Real Time PCR System. Временной и температурный профиль ПЦР содержал следующие этапы:  2 мин при 50 °С ,10 мин при 95 °С , 40 циклов при 95 °С  15 сек и 60 °С  1 мин. Был изучен полиморфизм гена бета-казеина 7 экзона в нуклеотидной последовательности GenBank (m 55158), в g.8101 С>А, (кодон 67) у крупного рогатого скота. Для достижения заявленного результата по определению аллельных вариантов гена бета-казеина CSN2 мы предлагаем использовать метод ПЦР в реальном времени с применением интеркалирующего красителя, который является универсальным для исследования многих видов генов, и обладает низкой стоимостью. 
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в том, что способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 гена бета-казеина CSN2 проводится методом ПЦР в реальном времени с использованием реакционной смеси для ПЦР, содержащей интеркалирующий краситель SYBR Green. Для достижения технического результата используются прямой праймер для аллеля А1 5/СТТСССТGG GCCCATCCA3/; прямой праймер для аллеля А2 5/СТТСССТGGGCCCATCCС3/; обратный праймер для А1, А2 5/AGAСТGGAGCAGAGGCAGAG3/, интеркалирующий краситель SYBR green, в составе реакционной смеси для ПЦР. Определение аллельного варианта гена А1/А2 происходит на основании сравнение амплификации гена с отрицательным контролем по пороговому циклу (Ct).
При использовании данного метода сохраняется надежность детекции аллелей А1 и А2 гена бета-казеина, при этом обеспечивается значительное удешевление анализа на больших массивах животных на популяционном уровне за счет отсутствия необходимости использования дорогих и специфических флуоресцентных зондов. 
Апробацию разработанного способа генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 гена CSN2 методом ПЦР в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR-GREEN провели в лаборатории ДНК-технологий ВНИИПлем на пробах ДНК от 88 быков-производителей ОАО «Архангельское племпредприятие». Валидацию разработанного метода проводили с помощью аллель-специфичной ПЦР с использованием анализа данных путем электрофорезного разделения амплифицированных фрагментов ДНК в агарозном геле, их визуализации по флуоресцентному свечению в ультрафиолете после окрашивания бромистым этидием и компьютерной регистрации полученных изображений электрофореграмм. По результатам исследований установлено достоверное совпадение аллельных вариантов и генотипов бета-казеина, выявленных путем ПЦР в реальном времени с универсальным красителем SYBR Green и с помощью аллель-специфической ПЦР с электрофорезным разделением амплификатов в агарозном геле, что свидетельствует о возможности использования данного метода для анализа аллельных вариантов и генотипов бета-казеина (CSN2).
В деятельности молелярно-генетических лабораторий в области селекции сельскохозяйственных животных
62.65.13
Биотехнология в животноводстве
Владимир
Ялуга
Леонтьевич
"Кандидат биологических наук"
"Старший научный сотрудник"
"6581-2023"
"58525077400"
"489262"
"https://elibrary.ru/author_items.asp?authorid=489262"
"0000-0002-0215-9715"
РОССИЯ
Валентин
Прожерин
Петрович
"Доктор сельскохозяйственных наук"
"Отсутствует"
"-"
"-"
"679560"
"http://sznii.vscc.ac.ru/uploads/fragment_page_files/2022/02/19597"
"0000-0001-6267-7242"
РОССИЯ
Любовь
Калашникова
Александровна
"Доктор биологических наук"
"Профессор"
"C-3263-2019"
"7004999143"
"131548"
"0000-0002-9760-5254"
РОССИЯ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
ВАЛЕРИЙ
ФАЛЬКОВ
НИКОЛАЕВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБУН ФИЦКИА УРО РАН
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР КОМПЛЕКСНОГО ИЗУЧЕНИЯ АРКТИКИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА Н.П. ЛАВЕРОВА УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
1032900004390
ИВАН
БОЛОТОВ
НИКОЛАЕВИЧ
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения