Генетическая конструкция для экспрессии рекомбинантных дезаминаз на основе АРОВЕС1 для направленной модификации цитозиновых оснований митохондриальной ДНК
МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК РЕДАКТИРОВАНИЕ МИТОХОНДИАЛЬНОЙ ДНК ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ ЦИТОЗИНА APOBEC1
Карта генетической конструкции pNtGGS1_APOBEC1_TALE была построена при помощи программного обеспечения SnapGene. Для сборки был использован каркас разработанной ранее генетической конструкции pMitoCas9, а также плазмида BE4-Gam (Addgene #100806). C плазмиды pMitoCas9 в две стадии был амплифицирован фрагмент, кодирующий Cox8 и 3xFLAG мотивы (для митохондриальной локализации белка и его детекции, соответственно), которым предшествует фрагмент Козака перед сайтом инициации трансляции. В исходной последовательности имелся сайт разрезания ферментом рестрикции BamHI. Это сайт был инактивирован с помощью 2-стадийной ПЦР за счет мутации G>T в положении 1. На втором этапе, был амплифицирован фрагмент, кодирующий дезаминазу APOBEC1 с плазмиды BE4-Gam (Addgene #100806) с последовательностью на 3’-конце, кодирующей пептидный линкер GGS и дополнительный сайт рестрикции BamHI для последующего внесения последовательности, кодирующей соответствующий ДНК-связывающий TALE-домен. Также с помощью ПЦР с BE4-Gam нарабатывался третий фрагмент для сборки конструкции без TALE домена, включающий следующие элементы: ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, промотор цитомегаловируса, а также последовательность, кодирующую сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (Bovine growth hormone polyadenylation signal). Далее, путем бесшовного клонирования по методу Гибсона данные три фрагмента соединяются в единую генетическую конструкцию, в которую впоследствии вставляется фрагмент, кодирующий TALE домен. Этот вектор получил название pNtGGS1. Техническим результатом изобретения является обеспечение системы редактирования точечных мутаций в мтДНК и способа доставки рекомбинантных дезаминаз в митохондрии клеток человека. Дополнительным техническим результатом является исправление точечных патогенных мутаций митохондриальной ДНК.
При помощи генетической конструкции для экспрессии рекомбинантных дезаминаз на основе АРОВЕС1 на клеточных линиях возможна коррекция мутаций в мтДНК (C>T) ассоциированных с развитием митохондриальных заболеваний. Также возможно создание новых мутаций в мтДНК (C>T) для моделирования митохондиальных заболеваний на клеточных линиях и изучения структуры и функций митоходниального генома.
Константин
Орищенко
Евгеньевич
зав. лабораторией
Кандидат биологических наук
Отсутствует
Q-6630-2016
34168182500
182198
https://assa.icgbio.ru/#/reports/person/547/
0000-0001-9718-9038
РОССИЯ
Дмитрий
Чуркин
Владимирович
проректор по научно-исследовательской деятельности
РОССИЯ
34.15.27
Генетическая инженерия
01.06.KM
GENETICS & HEREDITY
Владимир
Музыка
Владимирович
Сборка генетических конструкций и оценка функциональной активности in vitro. 25 %
РОССИЯ
Константин
Орищенко
Евгеньевич
Дизайн генетических конструкций, планирование экспериментальной работы и анализ полученных результатов. 50 %
РОССИЯ
Эльвира
Закирова
Гамиловна
Сборка генетических конструкций. 25 %
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
Новосибирский государственный университет; НГУ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет"
1025403658565
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения