Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости
Ротовая жидкость Биотехнология Стоматология
Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии и биотехнологии и может быть использовано для оценки уровня иммунной защиты от патогенной микрофлоры в ротовой жидкости и касается способа определения активности лизоцима в ротовой жидкости. Готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл. Полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0). После этого данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле. Изобретение обеспечивает разработку модифицированной методики определения активности лизоцима в малом объеме ротовой жидкости, оценивая уровень местного иммунитета рта у пациентов с отягощенным соматическим статусом, внедрение в практическое здравоохранение. 2 пр.


Изобретение относится к медицине, в частности к стоматологии и биотехнологии и может быть использовано для оценки уровня иммунной защиты от патогенной микрофлоры в ротовой жидкости, изучении ротовой жидкости при патологических процессах в полости рта, для определения эффективности индивидуальных средств гигиены рта.

Известен «Способ определения лизоцимной активности биологических объектов» (Патент RU №2294373, МПК C12Q 1/02, G01N 33/48 - 27.02.2007, Бюл. № 6), предусматривает выращивание тест-культуры Micrococcus lysodeicticus штамм №2665 ГИСК им. Тарасевича на жидкой питательной среде при температуре 27°С до оптической плотности 3,2-3,4. Подвергают лиофильной сушке. Из выращенной тест-культуры готовят суспензию, которую вносят в исследуемый биологический объект. После чего проводят вычисление лизоцимной активности биологического объекта по известному методу.

Недостаток данного способа: не определен уровень для соматически здоровых и с высоким уровнем активности кариеса пациентов; отсутствие количественного определения лизоцима в ротовой жидкости.

Известен «Способ определения активности лизоцима в биологической среде» (Патент BY №22808, МПК C12N 9/36, C12Q 1/06, G01N 33/48 - 2019.12.30), мясопептонном агаре выращивают культуру Micrococcus lysodeikticus, выделяют из нее пептидогликан, инкубируют его с 2%-ным раствором Конго красного и центрифугируют с получением пептидогликана, меченого Конго красным, затем готовят контрольную пробу, содержащую фосфатный буферный раствор, физиологический раствор и биологическую среду, и опытную пробу, содержащую фосфатный буферный раствор, пептидогликан, меченый Конго красным, и биологическую среду, пробы инкубируют и центрифугируют, в полученных надосадках определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 492 нм и вычисляют активность лизоцима Х в мкг/мл по формуле.

Недостатком данного технического решения является отсутствие количественного определения лизоцима в ротовой жидкости, необходимость выделение пептидогликана, необходимость дополнительных реактивов.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является «Способ определения активности лизоцима слюны» (Патент RU № 2170932 С1, МПК G01N 33/52 - 20.07.2001, Бюл. № 20), в котором определяют начальную оптическую плотность в растворе смеси слюны, разведенной в 15 раз, с микрококком, после чего смесь термостатируют в течение 10 мин и вновь измеряют оптическую плотность, а затем определяют активность лизоцима (АЛ) по формуле АЛ = (Д0 - ДК) ⋅ 200, где Д0 - начальная оптическая плотность смеси; ДК - конечная оптическая плотность смеси; 200 - коэффициент пересчета.

Данный патент принят за прототип.

Недостаток данного способа отсутствует количественное определение лизоцима в ротовой жидкости.

Задачей заявляемого изобретения является модифицирование методик определения активности лизоцима в ротовой жидкости, при которой будет возможно количественное определение лизоцима, оптимизация расчёта данных.

Полезность заявленного способа заключается в том, что благодаря полученным результатам предоставляется возможность определения количественного состава лизоцима в ротовой жидкости, что в свою очередь позволить определять состояние иммунного статуса ротовой жидкости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка модифицированной методики определения активности лизоцима в малом объеме ротовой жидкости, оценивается уровень местного иммунитета рта у пациентов с отягощенным соматическим статусом, внедрение в практическое здравоохранение.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что измеряют оптическую плотность, особенность заключается в том, что сначала готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл, полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0), после чего данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

Способ осуществляется следующим образом:

Готовят раствор с внесением в пробирку 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл ротовой жидкости, добавляют 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus штамм №25292 ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, приготовленную по оптическому стандарту мутности. Полученный раствор тщательно перемешивают и сразу производят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора, после чего помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, далее оптическую плотность замеряют на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0 - D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

Способ поясняется конкретными клиническими примерами.

Пример 1.

Ротовая жидкость взята у пациента без соматической патологии, но с высокой активностью кариеса.

На первом этапе осуществляется приготовление культуры Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл. Далее в каждую пробирку с пробами ротовой жидкости объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus. Тщательно перемешивают. Сразу же проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора. По данным измерения D0 равен 0,196. После чего помещают пробирки в термостат для инкубации на 2,5 часа при температуре 37°С. Через указанное время проводят повторное измерение оптическое плотности при аналогичных условиях. По данным измерения D1 равен 0,102.

Расчёт производится по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L - активность лизоцима;

D0 - оптическая плотность до инкубации;

D1 - оптическая плотность после инкубации.

L = (0,196-0,102) / 0,196 * 100% = 47,9%.

Пример 2.

Ротовая жидкость взята у пациента с психоневрологическими расстройствами и высоким уровнем активности кариеса.

На первом этапе осуществляется приготовление культуры Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл. Далее в каждую пробирку с пробами ротовой жидкости объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus. Тщательно перемешивают. Сразу же проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора. По данным измерения D0 равен 0,364. После чего помещают пробирки в термостат для инкубации на 2,5 часа при температуре 37°С. Через указанное время проводят повторное измерение оптическое плотности при аналогичных условиях. По данным измерения D1 равен 0,096.

Расчёт производится по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100% = (0,364-0,096) / 0,364 * 100% = 73,6%.

Таким образом, чем выше показатель, тем хуже иммунологический статус во рту.

По приведенным примерам видно, что в первом случае активность лизоцима ниже, чем во втором. Это свидетельствует о наличии патогенной микрофлоры и напряженном иммунном статусе примера 2.

Предлагаемый способ позволяет определять количественный состав лизоцима в ротовой жидкости, что, в свою очередь, позволить определять состояние иммунного статуса ротовой жидкости при наличии заболеваний на ранних этапах.

Формула изобретения

Способ определения активности лизоцима в ротовой жидкости, включающий измерение оптической плотности, отличающийся тем, что сначала готовят культуру Micrococcus lysodeicticus ГИСК им. Л.А. Тарасевича в концентрации 10 млрд кл/мл, далее в пробирку с ротовой жидкостью объёмом 1 мл вносят 3 мл 1% физиологического раствора и 1 мл взвеси Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10 млрд кл/мл, полученный раствор тщательно перемешивают и проводят измерение оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D0), после чего данный раствор помещают в термостат на 2,5 часа при температуре 37 градусов, после чего повторно измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2МП при длине волны 540 нм, зеленый светофильтр, в кювете толщиной слоя 0,5 см против 1% физиологического раствора (D1) и вычисляют активность лизоцима ротовой жидкости по формуле:

L = (D0-D1) / D0*100%,

где L – активность лизоцима;

D0 – оптическая плотность до инкубации;

D1 – оптическая плотность после инкубации.
Стоматология
Алена
Абдрашитова
Борисовна
Доцент
Кандидат медицинских наук
Доцент
-
-
РОССИЯ
Алексей
Созинов
Станиславович
Ректор
РОССИЯ
76.29.55
Стоматология и челюстно-лицевая хирургия
03.02.FY
DENTISTRY, ORAL SURGERY & MEDICINE
Алена
Абдрашитова
Борисовна
РОССИЯ
ФГБОУ ВО КАЗАНСКИЙ ГМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1021602848189
АЛЕКСЕЙ
СОЗИНОВ
СТАНИСЛАВОВИЧ
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения