Способ определения атерогенных микро-РНК в крови, у пациентов с каротидным атеросклерозом
каротидный атеросклероз микроРНК
Способ определения атерогенных микроРНК у пациентов с каротидным атеросклерозом, включающий выделение микроРНК с последующим проведением ПЦР с обратной транскрипцией и определением микроРНК, отличающийся тем, что выделение из крови атерогенных микроРНК выполняют в три этапа, на первом этапе проводят лизис эритроцитов путем перемешивания на вортексе образца крови в течение 10 секунд с Лизис-буфером RBC, затем инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют в течение 3 минут при 1000 об/мин для осаждения клеток, к полученному осадку вновь добавляют Лизис-буфер RBC, после чего к полученной лейкоцитарной взвеси добавляют буфер RL и встряхивают на вортоксе до получения гомогенного состояния - лизата, на втором этапе лизат пропускают через колонку и центрифугируют в течение 3 минут при 14000 об/мин, к полученной суспензии-смеси добавляют 70% спирт, вновь пропускают через колонку и центрифугируют в течение одной минуты при 6000 об/мин, полученную суспензию еще раз вносят в колонку и добавляют промывочный раствор А и центрифугируют в течение одной минуты при 14 об/мин, затем вносят в колонку DNase I и вновь центрифугируют в течение одной минуты при 14 об/мин, полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, на третьем этапе в колонку вновь дважды вносят промывочный раствор А и дважды центрифугируют в течение одной минуты при 14000 об/мин, затем колонку с образцом высушивают на воздухе в течение 2 минут и вносят в нее Elution solution А для элюирования микроРНК, после чего центрифугируют в течение одной минуты при 2000 об/мин и затем в течение двух минут при 14000 об/мин, далее проводят определение в полученном образце микроРНК количества их копий на амплификаторе CFX Touch, полученный образец вносят в мини-пробирку Эппендорфа в количеств 2 мкл, добавляют к образцу буфер 3 мкл Polly А, 3 мкл АТФ, 1,8 мкл фермента Polly А и 10,2 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 65°С в течение 10 минут, после чего вносят 18 мкл лигазного буфера, 27 мкл PEG 800 А, 3,6 мкл адаптера для лигирования, 9 мкл РНК-лигазы, 2,4 мкл дистиллированной воды и вновь полученную смесь инкубируют при 16°С в течение 1 часа, затем добавляют следующее: 36 мкл 5х BufferRT, 7,2 мкл смеси dNTP, 9 мкл праймера Universal RT, 15 мкл смеси Enzyme, 20 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 85°С в течение 5 минут, получая экстрагированный образец, и далее готовят раствор перемешивания 300 мкл MiR Amp master Mix, 30 мкл MiR Amp primer Mix и 210 мкл дистиллированной воды, после чего 45 мкл полученного раствора добавляют к 5 мкл экстрагированного образца и проводят ПЦР, начиная с этапа обратной транскрипции по следующей программе РНК-1: 1 цикл - 5 минут при температуре 95°С, 14 циклов - 30 секунд при температуре 60°С, 10 минут при температуре 99°С, затем удержание при температуре 4°С, далее образец вносят в 5 чистых мини-пробирок Эппендорфа по 5 мкл в каждую, в которые затем вносят по 4 мкл дистиллированной воды и праймеры-зонды микроРНК в количестве 2 мкл при следующем порядке внесения праймеров-зондов микроРНК: в первую - 126-5р; во вторую - 126-3р; в третью - 33а-5р; в четвертую - 21-5р; в пятую - 21-3р, затем в каждую пробирку добавляют 10 мкл раствора основной смеси, содержащей TaqMan Fast Advanced и буфер TaqMan Fast Advanced Buffer в соотношении 1:100 соответственно и проводят программу амплификации РНК-2: 1 цикл - 20 мин при температуре 95°С, 40 циклов по 1 минуте при температуре 95°С, затем удержание при температуре 4°С, получая при этом количество копий атерогенных микроРНК. Данный способ может быть использован в дальнейшем для диагностики прогрессирования каротидного атеросклероза, а также назначения (в случая выявления неблагоприятного профиля микроРНК) более агрессивной превентивной терапии.
Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к способу выделения и определения атерогенных микроРНК из биологических жидкостей у больных с атеросклерозом.
Маринэ
Танашян
Мовсесовна
Заместитель директора по научной работе
Доктор медицинских наук
Член-корреспондент РАН
AAH-5289-2019
6506228066
95477
0000-0002-5883-8119
РОССИЯ
Михаил
Пирадов
Александрович
Директор
РОССИЯ
76.29.51
Неврология
03.02.RT
CLINICAL NEUROLOGY
Маринэ
Танашян
Мовсесовна
Автор
РОССИЯ
Алла
Шабалина
Анатольевна
Автор
РОССИЯ
Полина
Кузнецова
Игоревна
Автор
РОССИЯ
Анастасия
Бурмак
Геннадьевна
Автор
РОССИЯ
Антон
Раскуражев
Алексеевич
Автор
РОССИЯ
Анастасия
Корнилова
Александровна
Автор
РОССИЯ
МИНОБРНАУКИ РОССИИ
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1187746579690
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные казенные учреждения
ФГБНУ НЦН
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научный центр неврологии"
1027739766812
Организация
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения