Способ оценки внутривидовой конкуренции токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп с помощью ПЦР в режиме реального времени
КОНКУРЕНЦИЯ ТОКСИГЕННЫЕ И НЕТОКСИГЕННЫЕ ШТАММЫ ПРАЙМЕРЫ ПЦР ДНК ХОЛЕРА VIBRIO CHOLERAE
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии. Описан способ оценки токсигенных и нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae O1 и O139 серогрупп с помощью ПЦР в режиме реального времени. Выделяют ДНК из исследуемого материала, осуществляют постановку ПЦР со специфическими праймерами и последующим анализом реакции амплификации. Амплификацию исследуемой ДНК проводят с помощью двух пар праймеров и двух зондов: ctxA5; GTTCCTCTTGCATGATCATAAAG, ctxA6; TATCGGGCAGATTCTAGACC, ctxA5Z; /ROX/-ACTCTGTCCTCTTGGCATAAGACCACCT-/BHQ2/ и cold1 ACAGGTTCGGTTAAGTGGTTT, cold2 ACCTGAAGTGATCGAATTGAAGT, coldZ_12 /R6G/ACTCCTGATAGTGGCGGCTCTGA /BHQ1/. В одной пробе одновременно определяют концентрацию токсигенных и атоксигнных холерных вибрионов. Первая пара праймеров и зонд ctxA5Z фиксируют токсигенные вибрионы по присутствию гена ctx, а вторая пара использует в качестве маркерного гена для нетоксигенных штаммов ген холодового шока csh1. Оценку внутривидовой конкуренции проводят по каналам HEX и ROX амплификатора относительно количества мишеней стандартных образцов ДНК, количественный результат вносят в соответствующие графы протокола, которые выражаются в виде десятичного логарифма количества клеток, чем больше концентрация при низких температурах, тем выше конкуренция штамма в возможности выживания. При этом перед постановкой ПЦР готовят стандартные препараты, содержащие известное количество ДНК токсигенных и нетоксигенных Vibrio cholerae, для этого массу токсигенного и нетоксигенного штаммов выращивают в течение суток на агаре Мартена рН 7,4 при температуре 37°С, потом готовят 1 млрд. бактериальной взвеси в 0,9% растворе хлорида натрия при рН 7,2 по стандартным образцам мутности, которые 10-кратно разводят до разведения 103, после смешивают полученные суспензии в разных разведениях, содержащих 108, 107 и 106 м.к./мл токсигенного и нетоксигенного штаммов, затем из трех полученных образцов выделяют ДНК, которые хранят при температуре 4°С до 30 суток для использования при постановке ПЦР. Кроме того, ПЦР проводят в объеме 25 мкл, и реакционная смесь содержит: 2,5 мкл буфера, 1 Ед Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мкМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ каждого из четырех праймеров ctxA5, ctxA6 и зонд ctxA5Z, меченный по ROX для выявления токсигенных вибрионов по наличию гена ctx, cold1, cold2 и зонд coldZ_12, меченный по R6G,0,5 мкМ каждого из двух праймеров 5 мкл ДНК -ДНК матрицы, оставшийся объем - вода. ПЦР реакции проводят с соблюдением режимов: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 30 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг и учет по каналу FAM при 67°С - 20 с. Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой и проведении исследований связанных с изучением особенностей биологии возбудителя, включая идентификацию штаммов возбудителя холеры, способных успешно конкурировать с нетоксигенными культурами.
Изобретение может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой и проведении исследований, связанных с изучением особенностей биологии возбудителя, включая идентификацию штаммов возбудителя холеры, способных успешно конкурировать с нетоксигенными культурами.
Сергей
Водопьянов
Олегович
Главный научный сотрудник
Доктор медицинских наук
Отсутствует
-
6701686549
289536
https://orcid.org/0000-0003-4336-0439
0000-0003-4336-0439
РОССИЯ
Алексей
Носков
Кимович
Директор
РОССИЯ
34.27.05
Методы и аппаратура в микробиологии
34.27.23
Экология микроорганизмов
01.06.QU
MICROBIOLOGY
Сергей
Водопьянов
Олегович
РОССИЯ
Алексей
Водопьянов
Сергеевич
РОССИЯ
Светлана
Титова
Викторовна
РОССИЯ
Елена
Меньшикова
Аркадьевна
РОССИЯ
Артем
Герасименко
Александрович
РОССИЯ
Владимир
Кругликов
Дмитриевич
РОССИЯ
Роспотребнадзор
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
1047796261512
Организация
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Федеральные государственные казенные учреждения
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора
Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
1026103278959
Организация
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Федеральные государственные бюджетные учреждения