2-Амино-1-бензамидо-5[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид, обладающий цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентных к химиопрепаратам
проапоптогенные свойства клетка органическая  химия
Изобретение относится к новому 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамиду формулы I, обладающему цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентных к химиопрепаратам. Технический результат: получено новое соединение, проявляющее противоопухолевую активность и низкую токсичность. 3 ил., 2 табл.

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)


Изобретение относится к области органической химии, производным пиррола, а именно, новому биологически активному - 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамиду I формулы:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

который может найти применение в медицине в качестве лекарственного противоопухолевого препарата.

Ближайшим структурным аналогом к заявленному соединению являются соединения - этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1H-пирролидин-3-карбоновых кислот общей формулы II, проявляющие противоопухолевую активность [Патент №2607920 Российская Федерация, МПК C07D 417/00, А61К 31/195. Этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1H-пирролидин-3-карбоновых кислот, проявляющие противоопухолевую активность, и способ их получения: №2015120527: заявл. 29.05.2015: опубл. 11.01.2017 / С.С. Зыкова, Н.М. Игидов, М.В. Киселев, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова].

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

В качестве эталона сравнения нами взят противоопухолевый препарат - паклитаксел [Патент №2059631, МПК C07D 305/14, A61K 31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: №91 5010248: заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентине Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью], ЛД 50 которого составляет 48 мг/кг.

В тесте острой токсичности ЛД 50 2-АНПК имеет токсичность более 1000 мг/кг.

Таким образом, токсичность 2-АНПК гораздо меньше, чем у прототипа биологической активности - паклитаксела.

Целью предлагаемого изобретения является синтез нового, ранее не описанного 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (I), обладающего цитотоксическими и проапоптогенными свойствами в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентным к химиопрепаратам.

Поставленная цель достигается получением 2-амино-1-бензамидо-5-[2-(нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден]-4-оксо-4,5-дигидро-1H-пиррол-3-карбоксамида (2-АНПК) (I), взаимодействием N-(5-(нафталин-1-ил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден)бензогидразида (II) с цианоацетамидом в присутствии триэтиламина в среде толуола по схеме:

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Методика получения 2-амино-1-бензамидо-5-(2-нафталин-1-ил)-2-оксоэтилиден)-4-оксо-4,5-дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (I). Смесь 1.71 г (0.005 моль) N-(5-(нафталин-1-ил)-2-оксофуран-3(2Н)-илиден)бензогидразида (II), 0.42 г (0.005 моль) цианоацетамида и 0.5 г (0.005 моль) триэтиламина кипятили в 60 мл толуола в течение 35 минут. Выпавший при охлаждении осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из смеси пропанол-2 - уксусная кислота (1:1). Получали 1.27 г (60%) кристаллического вещества (I) с Тпл 260-261°С. C24H18N4O4. ИК-спектр, ν/см-1, вазелиновое масло: 3406 (NH), 3337 (NH), 3206 (NH), 1701 (С=O), 1679 (С=O), 1628 (С=С) Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-d6), δ, м.д.: 6.69 с (1H, СН), 7.06 с (1Н, NH), 7.70 м (13Н, аром.), 8.80 уш. с (1Н, NH), 9.25 уш. с (1Н, NH), 11.11 с (1H, NH), 11.86 уш. с (1Н, NH). Спектр ЯМР 13С, δ, м.д., ДМСО-d6: 20.90, 87.64, 105.46, 124.71, 125.01, 126.27, 127.59, 127.90, 128.38, 129.27, 129.85, 130.95, 131.89, 132.96, 133.26, 134.99, 141.26, 165.30, 165.54, 166.96, 171.82, 176.00, 192.63.

Заявляемое соединение представляет собой светло-желтое кристаллическое вещество, растворимое в ДМСО, ДМФА, уксусной кислоте, при нагревании - в этиловом спирте, устойчивое при хранении.

Цитотоксическое и проапоптогенное действие соединения 2-АБПК устанавливали предварительно при помощи микроскопии, а затем количественно - с помощью МТТ-теста.

Изобретение подтверждается следующими графическими материалами, на которых представлено:

На фиг. 1 - морфология клеток ГИСО (GIST - T1-R), инкубированных с 2-АНПК и паклитакселом (положительный контроль) в течение 24 часов.

На фиг. 2 - дозо-зависимое повышение уровня расщепленных форм ПАРП и каспазы-3 в клеточной линии RD в присутствии 2-АНПК (5 и 10 μМ). Паклитаксел (1 μМ) использован в качестве положительного контроля. Клеточная линия проинкубирована с препаратами в течение 48 часов. В качестве контроля белковой загрузки был использован β-актин.

На фиг. 3 - цитотоксическая активность паклитаксела в отношении паклитаксел-наивных (GIST Т1 и НСС1806) и паклитаксел-резистентных клеточных линий (GIST T1-Tx-R и HCC1806-Tx-R). По оси абсцисс отражены дозы паклитаксела (0,000001-1000000 nM), по оси ординат - % жизнеспособности.

Микроскопическое исследование клеточной линии гастроинтестинальной стромальной опухоли (ГИСО) GIST - T1-R выявило выраженное снижение конфлюэнтности и усиление гибели клеток под действием 2-АНПК, аналогичное эффекту паклитаксела (Фигура 1). Подобные результаты были получены при исследовании других клеточных линий, в том числе клеток рака молочной железы, чувствительных и резистентных к паклитакселу (НСС1806 и HCC1806-TaxR), клеток ГИСО, чувствительных и резистентных к паклитакселу (GIST Т1 и GIST T1-TaxR), а также клеток лейомиосаркомы (SK-LMS-1), рабдомиосаркомы (RD) и остеосаркомы (U2OS).

Для дальнейшего определения механизма клеточной гибели был проведен анализ клеточных культур методом иммуноблоттинга. В клетках рабдомиосаркомы линии RD были определены следующие маркеры апоптоза: расщепленная форма эффекторной каспазы-3, расщепленная форма поли-АДФ-рибоза-полимеразы (ПАРП). Повышенные уровни указанных маркеров апоптоза были выявлены в образцах, инкубированных с 2-АНПК, паклитакселом (положительный контроль), при этом уровень маркеров в образце, инкубированном с исследуемым соединением, был сопоставим с эффектом препарата, используемого в качестве положительного контроля (Фигура 2). Аналогичные результаты были получены при исследовании других клеточных линий.

Цитотоксическая активность исследуемого соединения и паклитаксела была оценена при помощи МТТ-теста (Табл. 1).

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Было подтверждено, что половинная ингибирующая доза (IC50) паклитаксела для паклитаксел-резистентных клеточных линий (GIST Т1-Тх-R и HCC1806-Tx-R) была существенно выше, чем для паклитаксел-наивных клеток (GIST T1, GIST T1-R и НСС1806) (Фигура 3). В то же время, IC50 2-АНПК для паклитаксел-резистентных линий была сопоставима с IC50 для паклитаксел-наивных клеточных линий. Это свидетельствует о потенциальном преимуществе исследуемого соединения для лечения паклитаксел-резистентных опухолей.

Подтверждение гибели клеток GIST T1-IM-R по механизму апоптоза и анализ клеточного цикла был произведен методом проточной цитометрии (Flow Cytometer BD FACSCanto II). В образцах, инкубированных 48 часов с 2-АНПК и паклитакселом, выбранного в качестве положительного контроля, наблюдалось повышенное количество гиподиплоидных клеток (subG1). Результаты количественной оценки приведены в таблице 2.

Увеличенное изображение (открывается в отдельном окне)

Представленные результаты исследований показывают, что 2-АНПК обладает цитотоксической и проапоптогенной активностью в отношении клеток солидных опухолей человека, в том числе резистентным к химиопрепаратам.

Литература:

1. Патент №2607920 Российская Федерация, МПК C07D 417/00, А61К 31/195. Этиловые эфиры 2-амино-1-бензоиламино-4-оксо-5-(2-оксо-2-арил-этилиден)-4,5-дигидро-1Н-пирролидин-3-карбоновых кислот, проявляющие противоопухолевую активность, и способ их получения: №2015120527: заявл. 29.05.2015: опубл. 11.01.2017 / С.С. Зыкова, Н.М. Игидов, М.В. Киселев, С.В. Бойчук, А.Р. Галембикова.

2. Патент №2059631, МПК C07D 305/14, А61К 31/195. Производные таксола и фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью: №91 5010248: заявл. 29.11.1991: опубл. 10.05.1996 / Валентине Дж. Стелла, Абрахам Е. Мэтью.
Общая патология
Сергей
Бойчук
Васильевич
Заведующий кафедрой
Доктор медицинских наук
Профессор
-
-
РОССИЯ
Алексей
Созинов
Станиславович
Ректор
РОССИЯ
76.03.53
Патологическая физиология
03.01.TM
PATHOLOGY
Сергей
Бойчук
Васильевич
Руководство и разработка способа, апробация
РОССИЯ
Айгуль
Галембикова
Рафиковна
Разработка способа, апробация
РОССИЯ
ФГБОУ ВО КАЗАНСКИЙ ГМУ МИНЗДРАВА РОССИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
1021602848189
АЛЕКСЕЙ
СОЗИНОВ
СТАНИСЛАВОВИЧ
Организация
Министерство здравоохранения Российской Федерации
Федеральные государственные бюджетные учреждения