Разработка способа определения метастатического потенциала и риска возникновения рецидива при раке толстой кишки
Рак толстой кишки Иммуногистохимия метастазы рецидив онкосома
Введение
Колоректальный рак (КРР) является третьей по распространенности онкологической патологией в мире и занимает второе место в структуре смертности от злокачественных новообразований среди мужчин и женщин (Bray F. etal., 2018). В общей структуре онкологической заболеваемости Российской Федерации рак толстой и ободочной кишки составляет 11,9% и занимает третье место среди мужского и женского населения (Каприн А.Д. и др., 2019). Актуальна проблема КРР и для отдельных областей. Так, например, в Томской области в течение 2005 – 2015 гг. число больных колоректальным раком увеличилось на 39,9% (Одинцова И.Н., 2017). Выживаемость больных КРР в значительной степени связана со стадией заболевания на момент выявления. Пятилетняя выживаемость для больных КРР, диагностированных на ранней стадии, составляет более 90%, при диагностике на поздней стадии составляет приблизительно 7%. Особенность данного заболевания заключается в том, что почти в 20% случаев КРР изначально манифестирует как метастатический. Примерно у одной трети пациентов с неметастатическим КРР в течение трех лет возникают рецидивы опухоли или развиваются гематогенные метастазы (чаще в печень) (Loree J.M. etal., 2017).
Последние исследования показали, что потенциальные биомаркеры, ранее обнаруженные в сыворотке и моче, действительно сконцентрированы в экзосомах (vanNiel G. etal., 2018). Следовательно, выделение экзосом и анализ их содержания может иметь огромный диагностический и прогностический потенциал. 
Цели представляемой работы
В настоящее время без иммуногистохимических и молекулярно-генетических исследований, с целью диагностики, прогнозирования опухолей разных локализаций, не обходится ни одна современная патоморфологическая лаборатория. Современная литература насыщена огромным объемом информации посвященной диагностической иммуногистохимии. В нашей работе мы изучали ИГХ-позитивные мелкие частицы (от 50 до 100 нм). С целью выявления экзосом исследовались паренхиматозные элементы опухоли, просвет опухолевых желез, стромальные элементы вблизи и в периопухолевой ткани, а также свободнолежащие экзосомы в межклеточной среде.
Материалы, использованные в НИР.
Все больные, включеные в исследование, имели диагноз «рак толстой кишки», установленный в предопрационном периоде на основании гистологического подтверждения аденокарциномы в биоптате опухоли. Для определения стадии опухолевого процесса использовали классификацию TNM 7 издания.
Под местным рецидивом рака ПК понимали обнаружение с помощью различных диагностических методов признаков опухолевого роста в полости малого таза, как в области выполненного ранее вмешательства, так и в проекции лимфатических узлов запирательных пространств таза. Диагноз локорегионарного возврата злокачественного новообразования устанавливали в случае обнаружения факта наличия опухолевого роста в области ранее выполненной операции или в месте расположения сосудистых пучков, ответственных за кровоснабжение резецируемой части кишечника. 
Общая выживаемость оценивалась как вероятность дожития до определенного периода всех пациентов, включенных в исследование.
Безрецидивная выживаемость – параметр, обозначающий вероятность для оперированных пациентов пережить определенный период без признаков местного рецидивирования опухоли с момента первичного хирургического вмешательства.
Канцерспецифичная выживаемость оценивалась как вероятность для больных, подвергнутых оперативному лечению с радикальными намерениями, пережить заданный период времени без признаков проявления местного и отдаленного возврата заболевания. 
Для включения в исследование были использованы следующие критерии: морфологическое подтверждение аденогенного характера опухолевого процесса; выполнение оперативного вмешательства в радикальном объеме с D3 лимфодиссекцией.
Критериями исключения больных из исследования являлись: наличие соматических заболеваний в стадии декомпенсации; наличие или появление у больных причин, препятствующих проведению наблюдения в отдаленном послеоперационном периоде.
Анализу подвергнуты результаты патологоанатомического исследования удаленных препаратов: данные о гистологическом строении опухоли, в том числе глубина инвазии опухоли (стадия pТ по классификации TNM); количество и расположение исследованных регионарных лимфатических, проводилось исследование на предмет их поражения опухолевыми клетками; отдельно регистрировались сведения о наличии опухолевого роста в краях резекции удаленного препарата и признаков инвазии.
Иммуногистохимическое исследование
Исследования выполнялись пероксидазноантипероксидазным методом полимерной визуализационной системой DAKOR Kits (хромоге н DA B), учитывая установленные  рекоменда ции. Для выполнения метода  применялись химически чистые  стекла  Menzel-GläserPolysineslides, на  которые  устанавливали, изготовленные  из парафиновых блоков, срезы 4 мкм толщиной и сушили на  термостолике  в течение  12 ча сов при 37 °С. Окрашенные  гистологические  препараты оценивались количественно при увеличении
микроскопа  в 100 раз (объектив x10, окуляр х10). Для оценки опухолевых клеток выбира ли участки с самой высокой в количественном отношении экспрессией (горячие  точки). После  исследования трех полей зрения подсчитывали число положительно окрашенных ядер клеток от общего количества  подсчитанных клеток (в %), с помощью программы Ima geJ 1.4.3.67.
Микроскопическое  исследование  и микрофото изучение  выполняли на 
микроскопе  Nikon ECLIPSE Ci-S с использованием фотоприставки Nikon
DIGITA L SIGH DS – Vi1.
Результаты
MMP 9
Как известно, одним из ведущих факторов определяющих  инвазивные свойства опухоли, а также способность к метастазированию являются матриксные металлопротеиназы, в том числе и MMP-9. 
Матриксные металлопротеиназы (MMPs) образуют семейство ферментов, с основным действием – ремоделированием межклеточного матрикса (ECM) [7]. MMP-9, также известная как желатиназа B - это наиболее сложная металлопротеиназа в точки зрения доменной структуры и регуляции её активности. Активность MMP-9 находится под строгим контролем на различных уровнях: регуляция транскрипции гена цитокинами и различными клеточными взаимодействиями; регуляция активации профермента каскадом ферментов, включая сериновые протеазы и другие MMP; и регуляция специфическими тканевыми ингибиторами MMP (TIMP) или неспецифическими ингибиторами. Гликозилирование обладает ограниченным действием на активность желатиназы B, и хемотаксические факторы также контролируют ее активность. 
Основной функцией MMP является деградация компонентов внеклеточного матрикса. MMP ассоциированы с патологическими состояниями: такими, как ревматоидный артрит, болезнь коронарных сосудов и рак. MMP-9 способствует росту опухолевых клеток при метастазировании. Он играет важную роль в опухолевой инвазии и метастазировании, в ангиогенезе [8,9,10]. Показан повышенный уровень MMP-9 при колоректальном раке, остром лейкозе, раке молочной железы, злокачественной меланоме и раке мочевого пузыря. MMP-9 ассоциирована с метастазами в легких и инвазией глиомы.
Тканевой MMP-9 может служить независимым прогностическим маркером в колоректальном раке и количественное определение экспрессии MMP-9 может быть полезным в поиске пациентов, которые находятся в группе высокого риска развития рецидива заболевания. Иммуногистохимическая экспрессия MMP-9 достоверно положительно коррелирует с глубиной инвазии колоректального рака, метастазированием лимфатических узлов и отдаленным метастазированием. У пациентов с положительным окрашиванием MMP-9 значительно худшая выживаемость, чем у пациентов с отрицательным MMP-9 раком. 
Собственное исследование показало, что распределение экзосом, содержащих MMP-9, выражено не только в паренхиматозных элементах опухоли, но и просвете опухолевых желез, а также, в большом количестве обнаруживались в межклеточной среде (см. рис.1). Однако не все опухоли имели положительную реакцию на ММР-9, что возможно говорит о более слабых инвазивных свойствах опухолевых клеток.
CD 82
Фактор  супрессии  метастазов  KAI-1/CD82 подавляет прогрессирование и метастазирование широкого спектра солидных злокачественных опухолей. Вездесуще экспрессированный CD82 сдерживает миграцию клеток и клеточную инвазию, модулируя как клеточную матрицу, так и адгезивность клеток и ограничивая внешнюю сигнализацию про-моторики. Это ограничение, по крайней мере, способствует, если не определяет, метастаз-супрессивную активность, а также, вероятно, физиологические функции CD82. Как модулятор гетерогенности клеточной мембраны, CD82 изменяет микродомены, трафик и топографию мембраны, изменяя молекулярный ландшафт мембраны. Функциональная активность мембранных молекул и цитоскелетное взаимодействие клеточной мембраны впоследствии изменяются, за чем следуют изменения клеточных функций. Учитывая его патологическое и физиологическое значение, CD82 является перспективным кандидатом для клинического прогнозирования и блокирования прогрессии опухоли и метастазирования, а также новым модельным белком для механистического понимания организации и гетерогенности клеточных мембран.
Взаимодействует с белками клеточной поверхности, включая интегрины, кадгерины, CD4, CD8, IGSF8. Модулирует сигнал EGFR. Может подавлять инвазию, ингибируя интегрин-зависимые перекрестные помехи с рецептором c-Met и Src-киназами. Его регулирование с-мет сигнализации, видимо, влияет на раковые клетки миграции.
Собственные данные говорят о том, что распределение экзосом, содержащих CD-82, в большей степени отмечаются в цитоплазме паренхимазных элементов опухоли и в просвете опухолевых желез. Также положительную реакцию давали стромальные компоненты опухоли. Интересным фактом явилось неравномерное распределение окраски цитоплазмы опухолевых клеток – в одном случае положительная реакция наблюдалась по всей цитоплазме паренхиматозных элементов, в другом случае  положительная реакция отмечалась только вблизи люминальной поверхности цитоплазмы.
Исследование CD31 и S100 оказалось нецелесообразным в связи с не информативностью результатов. 
Заключение
Таким образом, описание распределения экзосом при иммуногистохимическом исследовании может служить дополнительным, независимым признаком злокачественного потенциала опухоли и требует дальнейшего исследования.
Патологоанатомические отделения лечебных учреждений
Сергей
Мозеров
Алексеевич
исполнитель
Доктор медицинских наук
Доцент
-
-
РОССИЯ
Мария
Малютина
Дмитриевна
исполнитель
РОССИЯ
76.29.49
Онкология
03.02.DM
ONCOLOGY
Мария
Малютина
Дмитриевна
исполнитель
РОССИЯ
Сергей
Мозеров
Алексеевич
исполнитель
РОССИЯ
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ФОНД СОДЕЙСТВИЯ ИННОВАЦИЯМ"
1051633002915
ГАЛИНА
СИЗОВА
ТИМОФЕЕВНА
Организация
Федеральное казначейство (федеральная служба)
Федеральные государственные казенные учреждения
Сергей
Мозеров
Алексеевич
Физическое лицо
РОССИЯ
Мария
Малютина
Дмитриевна
Физическое лицо
РОССИЯ